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Ceci818

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物与PMD18-T连接不上 已有7人参与

易错PCR产物回收后与pMD18-T连接，几乎都长蓝斑，长出两种蓝斑，一种是中间蓝色，边缘近白色，一种是全部都是蓝色的。连接时间是过夜连接，12-16h。有一次连接后长出蓝白斑，但是挑出的白斑做PCR验证之后都是假阳性。求各位大神相助。问题出现在哪里？求帮助！
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1楼 2015-03-30 16:15:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-03-31 09:42:07
请问你如何回收的？竟然能打到283.4ng每微升！！！还有就是你用的是taq酶吗？不要弄了半天你的PCR反应不会自动加A，那样无论如何也连接不上了。还有啊，你回收产物浓度这么高，为啥不直接送测...

每管50μ的体系，p了8管，回收了3管。就达到这个浓度了。用的是rtaq酶。有加A吖。那我直接送测好了。只是一直做不出来也很奇怪。所以不懂什么原因。
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16楼2015-04-01 10:45:57
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
18 t可以amp抗生素筛选呀。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2015-03-30 18:00:25
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Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 18:00:25
18 t可以amp抗生素筛选呀。

意思是说我不用蓝白斑筛选。直接加抗性，然后挑阳性是么？
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3楼2015-03-30 18:35:00
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781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Ceci818 at 2015-03-30 18:35:00
意思是说我不用蓝白斑筛选。直接加抗性，然后挑阳性是么？...

恩，我一直是这么好的，六个里面有三个是阳性。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-03-30 18:38:03
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Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 18:38:03
恩，我一直是这么好的，六个里面有三个是阳性。
...

我涂平板的时候有加Amp，为什么加上X-gal和IPTG之后就会出现这样的效果呢？而且有长出蓝白斑后我挑白斑，全部都是假阳性。是连接上面出了问题还是转化上面出了问题？
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5楼2015-03-30 18:57:56
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Ceci818(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-30 20:54:10
Ceci818: 金币+7, ★★★很有帮助 2015-04-02 20:37:43
应该是你的回收的目的基因浓度过低，建议你进行二次PCR之后回收产物，或者多管回收产物浓缩一下。低浓度产物连接效率很低，延长连接时间也没用，其实对18t来讲，1000bp的片段16度连接2h已经100%保险了，问题就是你的产物不好
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6楼2015-03-30 20:48:54
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Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-03-30 20:48:54
应该是你的回收的目的基因浓度过低，建议你进行二次PCR之后回收产物，或者多管回收产物浓缩一下。低浓度产物连接效率很低，延长连接时间也没用，其实对18t来讲，1000bp的片段16度连接2h已经100%保险了，问题就是你的 ...

我回收的PCR产物浓度是283.4μg/ml，我觉着挺高的吖。但是就是连接不上。。。
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7楼2015-03-31 09:36:58
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墨尔本机器

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Ceci818 at 2015-03-31 09:36:58
我回收的PCR产物浓度是283.4μg/ml，我觉着挺高的吖。但是就是连接不上。。。...

请问你如何回收的？竟然能打到283.4ng每微升！！！还有就是你用的是taq酶吗？不要弄了半天你的PCR反应不会自动加A，那样无论如何也连接不上了。还有啊，你回收产物浓度这么高，为啥不直接送测
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8楼2015-03-31 09:42:07
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shenma521

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Ceci818: 金币+2, ★有帮助 2015-04-02 20:37:32
换个载体连接一下，用blunt载体连接你的片段，blunt载体商业化的也别好用。
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9楼2015-03-31 14:59:10
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shenma521

铁虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-01 22:46:15
引用回帖:
9楼: Originally posted by shenma521 at 2015-03-31 14:59:10
换个载体连接一下，用blunt载体连接你的片段，blunt载体商业化的也别好用。

283.4μg/ml的片段 你需要电泳检测一下质量
直接取三微升的片段 加入 一微升的blunt 混匀放pcr仪内25度连接15分钟后直接连接转化 涂AMP平板 M13F+R挑克隆鉴定。
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10楼2015-03-31 15:04:59
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