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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物与PMD18-T连接不上
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zhang6871

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们现在都换成了pEasy-Blunt，背景TransGen的，很好用。
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过于功利，浮躁，布满灰尘的心都是创新的杀手!多记，心静，多动手，贴近大自然!
11楼2015-03-31 22:49:13
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mmcniu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也想问，pcr你用的是什么酶？tag酶吗？阳性率低，连接的时候你可以减少载体的量，说明说上让你加1微升的，你可以加0.25微升试试
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12楼2015-03-31 23:06:26
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mmcniu

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我们现在都用pGEM-T-EASY，也挺好用的
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13楼2015-03-31 23:07:24
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meier158

禁虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
14楼2015-03-31 23:48:39
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huisawang

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
高保真or普通taq??高保真酶要加A才能连上

[ 发自小木虫客户端 ]
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15楼2015-04-01 00:02:54
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Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-03-31 09:42:07
请问你如何回收的？竟然能打到283.4ng每微升！！！还有就是你用的是taq酶吗？不要弄了半天你的PCR反应不会自动加A，那样无论如何也连接不上了。还有啊，你回收产物浓度这么高，为啥不直接送测...

每管50μ的体系，p了8管，回收了3管。就达到这个浓度了。用的是rtaq酶。有加A吖。那我直接送测好了。只是一直做不出来也很奇怪。所以不懂什么原因。
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16楼2015-04-01 10:45:57
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Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by shenma521 at 2015-03-31 15:04:59
283.4μg/ml的片段 你需要电泳检测一下质量
直接取三微升的片段 加入 一微升的blunt 混匀放pcr仪内25度连接15分钟后直接连接转化 涂AMP平板 M13F+R挑克隆鉴定。...

好的。非常感谢~我换一下试试看。
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17楼2015-04-01 10:48:10
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shenma521

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by Ceci818 at 2015-04-01 10:48:10
好的。非常感谢~我换一下试试看。...

朋友你确定是用rtaq酶制备出的片段，这样的话你需要连接t载体，做TA克隆！

p18和blunt是平端的载体！！！！

[ 发自小木虫客户端 ]
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18楼2015-04-01 13:40:02
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liuan6126

铁杆木虫 (正式写手)
载体大小2700左右吧，片段如果很大或很浓的话，可能要适当提高载体的量。当然，片段超过4K，连接可能有点难度
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19楼2015-04-03 11:31:52
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 18:00:25
18 t可以amp抗生素筛选呀。

假阳性也是有抗性的啊
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20楼2015-12-29 11:16:58
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