应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物与PMD18-T连接不上
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
201/2返回列表12下一页
查看: 2718  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Ceci818

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物与PMD18-T连接不上 已有7人参与

易错PCR产物回收后与pMD18-T连接，几乎都长蓝斑，长出两种蓝斑，一种是中间蓝色，边缘近白色，一种是全部都是蓝色的。连接时间是过夜连接，12-16h。有一次连接后长出蓝白斑，但是挑出的白斑做PCR验证之后都是假阳性。求各位大神相助。问题出现在哪里？求帮助！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-03-30 16:15:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-03-31 09:42:07
请问你如何回收的？竟然能打到283.4ng每微升！！！还有就是你用的是taq酶吗？不要弄了半天你的PCR反应不会自动加A，那样无论如何也连接不上了。还有啊，你回收产物浓度这么高，为啥不直接送测...

每管50μ的体系，p了8管，回收了3管。就达到这个浓度了。用的是rtaq酶。有加A吖。那我直接送测好了。只是一直做不出来也很奇怪。所以不懂什么原因。
赞一下(1人) 回复此楼
16楼2015-04-01 10:45:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
18 t可以amp抗生素筛选呀。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
2楼2015-03-30 18:00:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 18:00:25
18 t可以amp抗生素筛选呀。

意思是说我不用蓝白斑筛选。直接加抗性，然后挑阳性是么？
赞一下 回复此楼
3楼2015-03-30 18:35:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

781055707

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Ceci818 at 2015-03-30 18:35:00
意思是说我不用蓝白斑筛选。直接加抗性，然后挑阳性是么？...

恩，我一直是这么好的，六个里面有三个是阳性。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
采菊东篱下，悠然见南山。
4楼2015-03-30 18:38:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 781055707 at 2015-03-30 18:38:03
恩，我一直是这么好的，六个里面有三个是阳性。
...

我涂平板的时候有加Amp，为什么加上X-gal和IPTG之后就会出现这样的效果呢？而且有长出蓝白斑后我挑白斑，全部都是假阳性。是连接上面出了问题还是转化上面出了问题？
赞一下 回复此楼
5楼2015-03-30 18:57:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨尔本机器

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Ceci818(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-03-30 20:54:10
Ceci818: 金币+7, ★★★很有帮助 2015-04-02 20:37:43
应该是你的回收的目的基因浓度过低，建议你进行二次PCR之后回收产物，或者多管回收产物浓缩一下。低浓度产物连接效率很低，延长连接时间也没用，其实对18t来讲，1000bp的片段16度连接2h已经100%保险了，问题就是你的产物不好
赞一下 回复此楼
6楼2015-03-30 20:48:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Ceci818

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 墨尔本机器 at 2015-03-30 20:48:54
应该是你的回收的目的基因浓度过低，建议你进行二次PCR之后回收产物，或者多管回收产物浓缩一下。低浓度产物连接效率很低，延长连接时间也没用，其实对18t来讲，1000bp的片段16度连接2h已经100%保险了，问题就是你的 ...

我回收的PCR产物浓度是283.4μg/ml，我觉着挺高的吖。但是就是连接不上。。。
赞一下 回复此楼
7楼2015-03-31 09:36:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨尔本机器

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Ceci818 at 2015-03-31 09:36:58
我回收的PCR产物浓度是283.4μg/ml，我觉着挺高的吖。但是就是连接不上。。。...

请问你如何回收的？竟然能打到283.4ng每微升！！！还有就是你用的是taq酶吗？不要弄了半天你的PCR反应不会自动加A，那样无论如何也连接不上了。还有啊，你回收产物浓度这么高，为啥不直接送测
赞一下 回复此楼
8楼2015-03-31 09:42:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenma521

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Ceci818: 金币+2, ★有帮助 2015-04-02 20:37:32
换个载体连接一下，用blunt载体连接你的片段，blunt载体商业化的也别好用。
赞一下 回复此楼
9楼2015-03-31 14:59:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shenma521

铁虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-04-01 22:46:15
引用回帖:
9楼: Originally posted by shenma521 at 2015-03-31 14:59:10
换个载体连接一下，用blunt载体连接你的片段，blunt载体商业化的也别好用。

283.4μg/ml的片段 你需要电泳检测一下质量
直接取三微升的片段 加入 一微升的blunt 混匀放pcr仪内25度连接15分钟后直接连接转化 涂AMP平板 M13F+R挑克隆鉴定。
赞一下 回复此楼
10楼2015-03-31 15:04:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Ceci818 的主题更新
201/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料工程专硕求调剂 +8 hyl3153942 2026-03-29 8/400 2026-03-30 20:45 by dophin1985
[考研] 295材料工程专硕求调剂 +10 1428151015 2026-03-27 10/500 2026-03-30 19:00 by 源_2020
[考研] 26考研-291分-厦门大学（085601）-柔性电子学院材料工程专业求调剂 +5 min3 2026-03-24 6/300 2026-03-30 18:42 by 544594351
[考研] 293求调剂 +3 末未mm 2026-03-30 5/250 2026-03-30 17:23 by 王保杰33
[考研] 0703化学/290求调剂/本科经历丰富/工科也可 +13 丹青奶盖 2026-03-26 15/750 2026-03-30 12:35 by fangnagu
[考研] 317求调剂 +10 蛋黄咸肉粽 2026-03-26 10/500 2026-03-30 09:45 by longlotian
[考研] 求调剂 +4 QiMing7 2026-03-25 5/250 2026-03-29 21:10 by 唐沐儿
[考研] 086000生物与医药调剂 +5 Feisty。 2026-03-28 9/450 2026-03-29 12:02 by longlotian
[考研] 2026年华南师范大学欢迎化学，化工，生物，生医工等专业优秀学子加入！ +3 llss0711 2026-03-28 6/300 2026-03-29 10:26 by llss0711
[硕博家园] 招收生物学/细胞生物学调剂 +4 IceGuo 2026-03-26 5/250 2026-03-29 01:25 by griffith2014
[考研] 299求调剂 +7 嗯嗯嗯嗯2 2026-03-27 7/350 2026-03-28 13:09 by 唐沐儿
[考研] 070300求调剂306分 +4 26要上岸 2026-03-27 4/200 2026-03-28 13:06 by 唐沐儿
[考研] 339求调剂，想调回江苏 +6 烤麦芽 2026-03-27 8/400 2026-03-28 10:40 by 烤麦芽
[考研] 286求调剂 +4 丢掉懒惰 2026-03-27 7/350 2026-03-28 08:07 by baoball
[考研] 266分求材料化工冶金矿业等专业的调剂 +4 哇呼哼呼哼 2026-03-26 4/200 2026-03-27 17:02 by zhyzzh
[考研] 调剂求收留 +7 果然有我 2026-03-26 7/350 2026-03-27 00:26 by wxiongid
[考研] 336材料求调剂 +7 陈滢莹 2026-03-26 9/450 2026-03-27 00:20 by wxiongid
[考研] 321求调剂 +6 Ymlll 2026-03-24 6/300 2026-03-26 20:50 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿北化315 求调剂 +3 akrrain 2026-03-24 3/150 2026-03-24 19:35 by 了了了了。。
[考研] 080500求调剂 +3 zzzzfan 2026-03-24 3/150 2026-03-24 16:38 by barlinike
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭