应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求助TCA沉淀浓度蛋白的问题
汕头大学海洋科学接受调剂
121/2返回列表12下一页
查看: 5142  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

id90

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助TCA沉淀浓度蛋白的问题 已有2人参与

我做的是毕赤酵母表达外源蛋白，由于蛋白的表达量较少，需要浓缩后，电泳分析。
我用的TCA方法是：  1mL 样品中加入180μL ~ 200μL 预冷的TCA，充分震荡，于4℃保存过夜。第二天离心去掉上清，加入200μL预冷的丙酮，洗涤两次。沉淀用缓冲液重溶，电泳。
我的问题是：样品是通过离子交换柱浓缩得到的、具有活性，但是加入TCA后没有沉淀出现，所以离心去上清的时候我保留几μL的液体，再加入丙酮，就会有白色沉淀出现。之后进行电泳，能看到目的蛋白。是不是TCA不能沉淀出蛋白，而丙酮将蛋白沉淀出来，也有人说丙酮沉淀出的是盐。求助我的方法是不是有问题，需要怎么改进？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-03-10 09:59:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

感谢参与，应助指数 +1
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2015-03-10 13:33:26
已阅   申请BioEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

帖航

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
id90: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2015-03-12 09:26:06
首先了解一下TCA沉淀的原理，TCA是酸，可以使蛋白变性，从而沉淀下来，另外TCA可以与蛋白形成不溶性的盐。总之TCA沉淀一般是不可逆的，也就是TCA是用来除杂蛋白的，而且效果是很明显的，你的样品加入TCA后没有沉淀是你的TCA浓度不够，你加大TCA浓度肯定有沉淀，可以做一个TCA梯度试试。
但是，个人建议，像我上述所说，TCA沉淀一般不可逆，所以建议你TAC沉淀过程尽量使你的目的蛋白保留在上清液中，然后用丙酮再纯化一次。
丙酮属于有机溶剂沉淀蛋白，是剥离蛋白的水化膜，从而使蛋白分子碰撞沉淀，稀释后可以复性。你所说的丙酮沉淀生成盐是错误的，酸还有重金属沉淀蛋白才会生成盐。
赞一下 回复此楼
3楼2015-03-10 14:25:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

id90

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 立林258369 at 2015-03-10 13:33:26
我曾经试过这种沉淀方法，效果一般，你的可能是初始蛋白浓度太低，冷冻干燥机干燥效果好一些，浓缩的不错，可以试一下

谢谢回复，冻干可以尝试下 。冻干后的盐会不会对电泳产生影响。
赞一下 回复此楼
4楼2015-03-10 16:36:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

id90

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 帖航 at 2015-03-10 14:25:42
首先了解一下TCA沉淀的原理，TCA是酸，可以使蛋白变性，从而沉淀下来，另外TCA可以与蛋白形成不溶性的盐。总之TCA沉淀一般是不可逆的，也就是TCA是用来除杂蛋白的，而且效果是很明显的，你的样品加入TCA后没有沉淀是 ...

谢谢回复，我用发酵液做TCA能看到有沉淀，离子交换浓缩没有。可能是我的目的蛋白含量太少，我准备做一个梯度试一试。如果使用丙酮纯化需要的浓度是多少？80%？
赞一下 回复此楼
5楼2015-03-10 16:49:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

帖航

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by id90 at 2015-03-10 16:49:38
谢谢回复，我用发酵液做TCA能看到有沉淀，离子交换浓缩没有。可能是我的目的蛋白含量太少，我准备做一个梯度试一试。如果使用丙酮纯化需要的浓度是多少？80%？...

具体多少浓度都是做预实验或者查文献的，不同的蛋白有不同的浓度，我以前做纯化时，用过50%也用过75%。这就考察本科时的实验功底了。还有离子交换浓缩我只听说过，具体的没见过，根据我多年的纯化经验，离子交换浓缩很难实现，过柱后不稀释已经很难得了，别说浓缩了。你可以问问GE分离纯化的技术部，他们肯定也不建议使用离子交换浓缩。至于TCA和丙酮他们其实是起到一个生物富集作用，纯化还是要过柱子的。纯化后再浓缩就不能在引入其他成分了（置换缓冲液除外），这是要考虑用PEG或者超滤管浓缩，有钱的就用分子筛干胶，转固体用冻干，真空干燥也可以考虑。喷雾干燥不适合。
赞一下 回复此楼
6楼2015-03-10 20:09:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

帖航

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 帖航 at 2015-03-10 20:09:25
具体多少浓度都是做预实验或者查文献的，不同的蛋白有不同的浓度，我以前做纯化时，用过50%也用过75%。这就考察本科时的实验功底了。还有离子交换浓缩我只听说过，具体的没见过，根据我多年的纯化经验，离子交换浓 ...

我又看了一眼你的问题，你是先过柱子再用TCA沉淀？哪有这么干的！
赞一下 回复此楼
7楼2015-03-10 20:19:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

id90

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 帖航 at 2015-03-10 20:19:51
我又看了一眼你的问题，你是先过柱子再用TCA沉淀？哪有这么干的！...

看来我没有表达清楚，我用离子交换柱纯化，得到的样品直接电泳看不到条带，我用TCA是为了浓缩再跑电泳。TCA后是为了跑电泳，不是为了后期纯化。
赞一下 回复此楼
8楼2015-03-11 00:02:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Pangtai

新虫 (初入文坛)
内容已删除
回复此楼
9楼2015-10-29 19:59:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gao19890724

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Pangtai at 2015-10-29 19:59:35
想问楼主问题解决了吗？最近我也在用TCA浓缩蛋白，用于SDS-PAGE。用的16%终浓度的TCA,加入后有沉淀产生，用丙酮洗两次后，加入缓冲液并不能重溶这些沉淀，不知道诸位是否遇到过这个问题；因此后续电泳跑出了成团的拖 ...

你的问题解决了吗？
赞一下 回复此楼
10楼2015-11-17 16:43:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 id90 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 284求调剂 +10 让我上岸吧阿西 2026-04-09 10/500 2026-04-13 17:05 by 张zhihao
[硕博家园] 有没有学校材料专业收跨调(一志愿085410) +13 momo(上岸版) 2026-04-06 16/800 2026-04-13 15:27 by Xurambo2014
[考研] 327求调剂 +16 Xxjc1107. 2026-04-06 17/850 2026-04-13 14:54 by ajpv风雷
[考研] 085801电气专硕272求调剂 +10 电气李 2026-04-13 11/550 2026-04-13 14:43 by 852137818
[考研] 调剂求收留 +30 果然有我 2026-04-10 31/1550 2026-04-13 14:18 by 张zhihao
[考研] 人工智能320调剂08工类还有机会吗 +15 振—TZ 2026-04-10 16/800 2026-04-13 14:11 by 张zhihao
[考研] 材料考研调剂 +29 云木达达 2026-04-11 31/1550 2026-04-13 13:32 by lyh鲁老师
[考研] 考研二轮调剂 +10 故人?? 2026-04-09 10/500 2026-04-13 09:55 by szhize
[材料工程] 材料调剂推荐 +9 蛋糕x2 2026-04-07 9/450 2026-04-13 09:07 by lhj2009
[考研] 一志愿中国科学院上海有机所，有机化学356分找调剂 +12 Nadiums 2026-04-09 12/600 2026-04-13 08:50 by lhj2009
[考研] 考研求调剂 +3 ban班小七 2026-04-11 3/150 2026-04-11 20:48 by may_新宇
[考研] 11408。358求调剂 +3 TMYzds 2026-04-07 3/150 2026-04-11 17:10 by 氮气气气
[考研] 352 求调剂 +6 yzion 2026-04-11 8/400 2026-04-11 16:24 by 明月此时有
[考研] 298求调剂 +5 残荷新柳 2026-04-07 5/250 2026-04-11 11:02 by 紫曦紫棋
[考研] 083200 305分 求二轮调剂 不接受跨专业 +9 Claireyyyy 2026-04-09 10/500 2026-04-10 21:21 by Claireyyyy
[考研] 计算机类求调剂，22408-274分 +7 上岸de小虫 2026-04-09 8/400 2026-04-10 19:56 by fxue1114
[考研] 332，085601求调剂 +12 ydfyh 2026-04-09 14/700 2026-04-09 17:28 by wp06
[考研] 调剂 +12 月@163.com 2026-04-08 12/600 2026-04-09 14:27 by rl1980
[考研] 086000生物与医药调剂 +7 awwwwwooooo 2026-04-09 7/350 2026-04-09 13:31 by 北极159263
[考研] 求调剂 +3 猪肉墩粉条cc 2026-04-08 4/200 2026-04-09 10:05 by 猪肉墩粉条cc
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭