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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求助TCA沉淀浓度蛋白的问题
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id90

铜虫 (初入文坛)

[求助] 求助TCA沉淀浓度蛋白的问题 已有2人参与

我做的是毕赤酵母表达外源蛋白，由于蛋白的表达量较少，需要浓缩后，电泳分析。
我用的TCA方法是：  1mL 样品中加入180μL ~ 200μL 预冷的TCA，充分震荡，于4℃保存过夜。第二天离心去掉上清，加入200μL预冷的丙酮，洗涤两次。沉淀用缓冲液重溶，电泳。
我的问题是：样品是通过离子交换柱浓缩得到的、具有活性，但是加入TCA后没有沉淀出现，所以离心去上清的时候我保留几μL的液体，再加入丙酮，就会有白色沉淀出现。之后进行电泳，能看到目的蛋白。是不是TCA不能沉淀出蛋白，而丙酮将蛋白沉淀出来，也有人说丙酮沉淀出的是盐。求助我的方法是不是有问题，需要怎么改进？
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1楼 2015-03-10 09:59:43
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匿名

感谢参与，应助指数 +1
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2楼2015-03-10 13:33:26
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帖航

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
id90: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2015-03-12 09:26:06
首先了解一下TCA沉淀的原理，TCA是酸，可以使蛋白变性，从而沉淀下来，另外TCA可以与蛋白形成不溶性的盐。总之TCA沉淀一般是不可逆的，也就是TCA是用来除杂蛋白的，而且效果是很明显的，你的样品加入TCA后没有沉淀是你的TCA浓度不够，你加大TCA浓度肯定有沉淀，可以做一个TCA梯度试试。
但是，个人建议，像我上述所说，TCA沉淀一般不可逆，所以建议你TAC沉淀过程尽量使你的目的蛋白保留在上清液中，然后用丙酮再纯化一次。
丙酮属于有机溶剂沉淀蛋白，是剥离蛋白的水化膜，从而使蛋白分子碰撞沉淀，稀释后可以复性。你所说的丙酮沉淀生成盐是错误的，酸还有重金属沉淀蛋白才会生成盐。
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3楼2015-03-10 14:25:42
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id90

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 立林258369 at 2015-03-10 13:33:26
我曾经试过这种沉淀方法，效果一般，你的可能是初始蛋白浓度太低，冷冻干燥机干燥效果好一些，浓缩的不错，可以试一下

谢谢回复，冻干可以尝试下 。冻干后的盐会不会对电泳产生影响。
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4楼2015-03-10 16:36:06
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id90

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 帖航 at 2015-03-10 14:25:42
首先了解一下TCA沉淀的原理，TCA是酸，可以使蛋白变性，从而沉淀下来，另外TCA可以与蛋白形成不溶性的盐。总之TCA沉淀一般是不可逆的，也就是TCA是用来除杂蛋白的，而且效果是很明显的，你的样品加入TCA后没有沉淀是 ...

谢谢回复，我用发酵液做TCA能看到有沉淀，离子交换浓缩没有。可能是我的目的蛋白含量太少，我准备做一个梯度试一试。如果使用丙酮纯化需要的浓度是多少？80%？
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5楼2015-03-10 16:49:38
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帖航

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by id90 at 2015-03-10 16:49:38
谢谢回复，我用发酵液做TCA能看到有沉淀，离子交换浓缩没有。可能是我的目的蛋白含量太少，我准备做一个梯度试一试。如果使用丙酮纯化需要的浓度是多少？80%？...

具体多少浓度都是做预实验或者查文献的，不同的蛋白有不同的浓度，我以前做纯化时，用过50%也用过75%。这就考察本科时的实验功底了。还有离子交换浓缩我只听说过，具体的没见过，根据我多年的纯化经验，离子交换浓缩很难实现，过柱后不稀释已经很难得了，别说浓缩了。你可以问问GE分离纯化的技术部，他们肯定也不建议使用离子交换浓缩。至于TCA和丙酮他们其实是起到一个生物富集作用，纯化还是要过柱子的。纯化后再浓缩就不能在引入其他成分了（置换缓冲液除外），这是要考虑用PEG或者超滤管浓缩，有钱的就用分子筛干胶，转固体用冻干，真空干燥也可以考虑。喷雾干燥不适合。
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6楼2015-03-10 20:09:25
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帖航

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 帖航 at 2015-03-10 20:09:25
具体多少浓度都是做预实验或者查文献的，不同的蛋白有不同的浓度，我以前做纯化时，用过50%也用过75%。这就考察本科时的实验功底了。还有离子交换浓缩我只听说过，具体的没见过，根据我多年的纯化经验，离子交换浓 ...

我又看了一眼你的问题，你是先过柱子再用TCA沉淀？哪有这么干的！
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7楼2015-03-10 20:19:51
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id90

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 帖航 at 2015-03-10 20:19:51
我又看了一眼你的问题，你是先过柱子再用TCA沉淀？哪有这么干的！...

看来我没有表达清楚，我用离子交换柱纯化，得到的样品直接电泳看不到条带，我用TCA是为了浓缩再跑电泳。TCA后是为了跑电泳，不是为了后期纯化。
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8楼2015-03-11 00:02:02
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Pangtai

新虫 (初入文坛)
内容已删除
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9楼2015-10-29 19:59:35
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gao19890724

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Pangtai at 2015-10-29 19:59:35
想问楼主问题解决了吗？最近我也在用TCA浓缩蛋白，用于SDS-PAGE。用的16%终浓度的TCA,加入后有沉淀产生，用丙酮洗两次后，加入缓冲液并不能重溶这些沉淀，不知道诸位是否遇到过这个问题；因此后续电泳跑出了成团的拖 ...

你的问题解决了吗？
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10楼2015-11-17 16:43:17
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