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youngsun50木虫 (正式写手)
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[求助]
双向电泳条纹等问题求助
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各位大侠，我的样品（G-细菌）裂解后经TCA丙酮沉淀处理的，复溶时大约损失了1/3，水化上样大约900ug，胶条pH3-10,24cm,如图到处都是横条纹，应该是没有聚焦完全（条件8KV，72KVh）请问 1）难道TCA丙酮沉淀除盐不彻底吗，有人说直接用超滤除盐就行不知效果如何 2）胶条pH选择问题，我的大多集中在4-8之间，太密集了，但也有的在之外，不知用重新选择吗 3）聚丙烯酰胺凝胶破碎问题，10%，操作过程中经常破碎 结果如下图，希望有做过的大侠指点一下，谢谢   +到-，pH3-10（线性），24cm |
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 蛋白质生物学实验经验 | 电泳、bio-rad 电转化仪及操作 |
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【答案】应助回帖
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youngsun50: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 应助指数+1 2012-05-22 15:24:14
youngsun50: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 应助指数+1 2012-05-22 15:24:14
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TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。 超滤除盐没做过。 楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。 胶条的选择，初次跑摸条件肯定要用宽范围的，找到感兴趣的蛋白再用窄范围的。 胶破碎问题，一般情况下胶是比较有韧性的，不很容易裂，拿的时候小心就是。如果胶很脆，考虑缓冲液的pH是否正常。制备好的胶最好马上用，保存的话要保鲜膜包好，加水或者胶buffer。不包的话很快就干了。 希望对你有用。 |
2楼2012-05-22 10:34:52
youngsun50
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你好，谢谢你上次的帮助，这次又做了一遍，还是不理想，希望你有空再指点一下： 1）我的page胶重新换了所用的母液，并且确定tris ph正确，试制了一次10%的还是容易破，试制了次12.5%(4h凝固后，没有上胶条电泳，直接拆下操作)，没有破感觉韧性挺好。但到我正式做的时候（凝固过夜），用水饱和正丁醇封胶了但胶面中间高出，请问封胶时用把倒胶的凹槽处也封死吗，我之前封死也没这个影响啊，正丁醇的量没影响吧。电泳拆下后发现还是容易破，纠结啊，是不是凝固室温放置时间长了也不好啊？ 2）结果不理想，还是横条纹严重，具体条件如下。 样品制备：收集菌体，10mMtris, 5mM醋酸镁洗涤，后菌体湿重300mg加入了1ml的裂解液（尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM, IPG buffer2%，并加 PMSF），超声破碎，离心18000g,1.5h，后进行了超滤除盐，大约将原盐浓度降低了100倍。定量为20ug/ul，取30ul加入了500ul水化液（尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT18.2mM,IPGbuffer 0.5%）中，水化上样量大约500ug。 IEF条件为：30v,step,20v; 200v,grad,2h; 500v,grad,2h; 1000v,grad,5h; 10000v,grad,3h; 10000v,step,10万Vh; 1000v,step,hold。结果显示电流在聚焦10000v进行约6h后就降至了15uA,在之后的4h内电流基本未变（听工程师说电流降至20uA才算聚焦可以，之前两次都没有达到，这次至少说明除盐效果有了），我在1000v 4h之后才开始进行平衡二维电泳。电流检测（电压与设置的一样）及电泳结果如附件： 请问：为什么还有横条纹呢，是我聚焦过了吗（看说明书写聚焦过了也会产生横条纹）？10000v过高？还是1000vhold的时候有可能再次扩散了？ 谢谢  电泳结果，左正右负，ph3-10,24cm,12.5%PAGE胶  电流检测结果 |
10楼2012-06-24 12:40:53
