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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双向电泳条纹等问题求助
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-06-24 12:40:53
你好，谢谢你上次的帮助，这次又做了一遍，还是不理想，希望你有空再指点一下：
1）我的page胶重新换了所用的母液，并且确定tris ph正确，试制了一次10%的还是容易破，试制了次12.5%(4h凝固后，没有上胶条电泳，直 ...

1：胶的问题我也不清楚是怎么回事，我制的时候是凝过夜的，用水饱和正丁醇封，覆盖保鲜膜，约1～2h后补加一些去离子水在上面。很少见胶脆。胶中部心电图样的纹说明凝的不好。要不选用更好的试剂？我用的是Sigma的产品。
2：电流说明除盐已经很好了。横向拖尾可能是聚焦过度了。程序设置为什么不是200v step 2h，这么低电压不用梯度升压吧？。倒是10000v的时候要梯度升压，你设置的反而是step。前面200，500，1000的时间是不是长了点？这几步主要是让盐离子、溴酚蓝什么的跑，不是在聚焦，所以时间可以短点。还有，10000v之后为什么要加个1000v？不是很明白。可以直接二向，或者冻在冰箱里的（－20一天，－80一周）
学识有限，欢迎讨论，指正。
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11楼2012-06-25 21:03:51
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-06-25 21:03:51
1：胶的问题我也不清楚是怎么回事，我制的时候是凝过夜的，用水饱和正丁醇封，覆盖保鲜膜，约1～2h后补加一些去离子水在上面。很少见胶脆。胶中部心电图样的纹说明凝的不好。要不选用更好的试剂？我用的是Sigma的产 ...

谢谢！
1）封胶时，水饱和正丁醇的量不严格吧，我一块胶封了2-3ml,而且倒胶凹槽处也加了2ml，这个有影响吗？我胶面中间突出了。 那个胶中间心电图应该是气泡引起的，制胶时中间出现了三个气泡。
2）我那个程序是采用GE工程师给的，时间延长是因为要过夜到早晨，1000v hold 此步也是如此。能把你常用的程序列一下吗，参照一下。
另外，还有就是我的低熔点琼脂糖封胶时，凝固二十分钟后有点凝了，但还是很“水”的样子，你的也这样吗

谢谢
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学会感恩，强大自我
12楼2012-06-25 21:46:52
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
youngsun50: 金币+10 2012-06-26 16:52:57
引用回帖:
12楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-06-25 21:46:52
谢谢！
1）封胶时，水饱和正丁醇的量不严格吧，我一块胶封了2-3ml,而且倒胶凹槽处也加了2ml，这个有影响吗？我胶面中间突出了。 那个胶中间心电图应该是气泡引起的，制胶时中间出现了三个气泡。
2）我那个程序是 ...

水饱和正丁醇的量不严格，覆盖了就行了。
低熔点琼脂糖凝的较慢，但没见过很水的样子，玻璃板倾斜的时候是不会流动的。
我常用的程序是：
30v 7h，60v 7h（这两步水化），200v、500v、1000v各1h，Grad 10000v，1.5h，10000v至50000~100000vhrs。跑完要是不继续二向，就冻－80度。
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13楼2012-06-26 15:36:46
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
13楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-06-26 15:36:46
水饱和正丁醇的量不严格，覆盖了就行了。
低熔点琼脂糖凝的较慢，但没见过很水的样子，玻璃板倾斜的时候是不会流动的。
我常用的程序是：
30v 7h，60v 7h（这两步水化），200v、500v、1000v各1h，Grad 10000v， ...

谢谢一直的帮助
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学会感恩，强大自我
14楼2012-06-26 16:53:32
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康熙61

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 10:34:52
TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。
超滤除盐没做过。
楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。
胶条的选择，初次跑 ...

你双向电泳做的怎么样？可以告诉我 你提取蛋白的方法吗？我做组织和细胞。组织有肝组织 肾组织之类的 谢谢
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15楼2014-06-13 11:40:15
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 康熙61 at 2014-06-13 11:40:15
你双向电泳做的怎么样？可以告诉我 你提取蛋白的方法吗？我做组织和细胞。组织有肝组织 肾组织之类的 谢谢...

我早不做了，自己尝试了半年不理想，最后送到华大蛋白公司做了多次也不理想。。。
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学会感恩，强大自我
16楼2014-06-14 12:22:38
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