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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 双向电泳条纹等问题求助
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youngsun50

木虫 (正式写手)

[求助] 双向电泳条纹等问题求助

各位大侠，我的样品（G-细菌）裂解后经TCA丙酮沉淀处理的，复溶时大约损失了1/3，水化上样大约900ug，胶条pH3-10,24cm,如图到处都是横条纹，应该是没有聚焦完全（条件8KV，72KVh）请问
1）难道TCA丙酮沉淀除盐不彻底吗，有人说直接用超滤除盐就行不知效果如何
2）胶条pH选择问题，我的大多集中在4-8之间，太密集了，但也有的在之外，不知用重新选择吗
3）聚丙烯酰胺凝胶破碎问题，10%，操作过程中经常破碎
结果如下图，希望有做过的大侠指点一下，谢谢

+到-，pH3-10（线性），24cm
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学会感恩，强大自我
1楼 2012-05-10 17:38:20
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-06-24 12:40:53
你好，谢谢你上次的帮助，这次又做了一遍，还是不理想，希望你有空再指点一下：
1）我的page胶重新换了所用的母液，并且确定tris ph正确，试制了一次10%的还是容易破，试制了次12.5%(4h凝固后，没有上胶条电泳，直 ...

1：胶的问题我也不清楚是怎么回事，我制的时候是凝过夜的，用水饱和正丁醇封，覆盖保鲜膜，约1～2h后补加一些去离子水在上面。很少见胶脆。胶中部心电图样的纹说明凝的不好。要不选用更好的试剂？我用的是Sigma的产品。
2：电流说明除盐已经很好了。横向拖尾可能是聚焦过度了。程序设置为什么不是200v step 2h，这么低电压不用梯度升压吧？。倒是10000v的时候要梯度升压，你设置的反而是step。前面200，500，1000的时间是不是长了点？这几步主要是让盐离子、溴酚蓝什么的跑，不是在聚焦，所以时间可以短点。还有，10000v之后为什么要加个1000v？不是很明白。可以直接二向，或者冻在冰箱里的（－20一天，－80一周）
学识有限，欢迎讨论，指正。
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11楼2012-06-25 21:03:51
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
youngsun50: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 应助指数+1 2012-05-22 15:24:14
TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。
超滤除盐没做过。
楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。
胶条的选择，初次跑摸条件肯定要用宽范围的，找到感兴趣的蛋白再用窄范围的。
胶破碎问题，一般情况下胶是比较有韧性的，不很容易裂，拿的时候小心就是。如果胶很脆，考虑缓冲液的pH是否正常。制备好的胶最好马上用，保存的话要保鲜膜包好，加水或者胶buffer。不包的话很快就干了。
希望对你有用。
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2楼2012-05-22 10:34:52
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 10:34:52:
TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。
超滤除盐没做过。
楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。
胶条的选择，初次跑

谢谢！
10万vhrs?那你的电压是8kv吗，我用的GE系统，说用strip holder是最大电压8k。我的裂解液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM,未加IPG buffer; 水化液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%DTT18.2mM,IPGbuffer 约1.3%。 请问那你一般怎么处理样品，不用除盐吗，我做了未除盐处理的条纹更严重,你TCA丙酮沉淀后条纹没用吗?
另我水化液中DTT，IPG buffer比规定的多些，影响大吗？
另，最后染色是一块胶一个托盘摇吗
新手问题有点多，希望不要烦啊
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学会感恩，强大自我
3楼2012-05-22 12:50:50
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Rubisco580

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-05-22 12:50:50:
谢谢！
10万vhrs?那你的电压是8kv吗，我用的GE系统，说用strip holder是最大电压8k。我的裂解液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM,未加IPG buffer; 水化液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%DTT18.2mM,IPGbuffer 约1.3%

我用的也是GE系统，聚焦是1万伏，8000也用过，差不多。
我处理的样品是细胞系，PBS清洗后离心，吸干液体后倒扣在吸水纸上面一会，然后再加裂解液的。没有特别的除盐步骤。
DTT和IPG buffer加多了会影响电泳，还是悠着点。
染色的时候是一块胶一个托盘。
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4楼2012-05-22 13:48:21
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