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youngsun50木虫 (正式写手)
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[求助]
双向电泳条纹等问题求助
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各位大侠，我的样品（G-细菌）裂解后经TCA丙酮沉淀处理的，复溶时大约损失了1/3，水化上样大约900ug，胶条pH3-10,24cm,如图到处都是横条纹，应该是没有聚焦完全（条件8KV，72KVh）请问 1）难道TCA丙酮沉淀除盐不彻底吗，有人说直接用超滤除盐就行不知效果如何 2）胶条pH选择问题，我的大多集中在4-8之间，太密集了，但也有的在之外，不知用重新选择吗 3）聚丙烯酰胺凝胶破碎问题，10%，操作过程中经常破碎 结果如下图，希望有做过的大侠指点一下，谢谢   +到-，pH3-10（线性），24cm |
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Rubisco580
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【答案】应助回帖
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1：胶的问题我也不清楚是怎么回事，我制的时候是凝过夜的，用水饱和正丁醇封，覆盖保鲜膜，约1～2h后补加一些去离子水在上面。很少见胶脆。胶中部心电图样的纹说明凝的不好。要不选用更好的试剂？我用的是Sigma的产品。 2：电流说明除盐已经很好了。横向拖尾可能是聚焦过度了。程序设置为什么不是200v step 2h，这么低电压不用梯度升压吧？。倒是10000v的时候要梯度升压，你设置的反而是step。前面200，500，1000的时间是不是长了点？这几步主要是让盐离子、溴酚蓝什么的跑，不是在聚焦，所以时间可以短点。还有，10000v之后为什么要加个1000v？不是很明白。可以直接二向，或者冻在冰箱里的（－20一天，－80一周） 学识有限，欢迎讨论，指正。 |
11楼2012-06-25 21:03:51
Rubisco580
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
youngsun50: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 应助指数+1 2012-05-22 15:24:14
youngsun50: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 应助指数+1 2012-05-22 15:24:14
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TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。 超滤除盐没做过。 楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。 胶条的选择，初次跑摸条件肯定要用宽范围的，找到感兴趣的蛋白再用窄范围的。 胶破碎问题，一般情况下胶是比较有韧性的，不很容易裂，拿的时候小心就是。如果胶很脆，考虑缓冲液的pH是否正常。制备好的胶最好马上用，保存的话要保鲜膜包好，加水或者胶buffer。不包的话很快就干了。 希望对你有用。 |
2楼2012-05-22 10:34:52
youngsun50
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3楼2012-05-22 12:50:50
Rubisco580
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