[求助] 双向电泳条纹等问题求助

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1楼2012-05-10 17:38:20

youngsun50

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2楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 10:34:52:
TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。
超滤除盐没做过。
楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。
胶条的选择，初次跑

谢谢！
10万vhrs?那你的电压是8kv吗，我用的GE系统，说用strip holder是最大电压8k。我的裂解液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM,未加IPG buffer; 水化液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%DTT18.2mM,IPGbuffer 约1.3%。请问那你一般怎么处理样品，不用除盐吗，我做了未除盐处理的条纹更严重,你TCA丙酮沉淀后条纹没用吗?
另我水化液中DTT，IPG buffer比规定的多些，影响大吗？
另，最后染色是一块胶一个托盘摇吗
新手问题有点多，希望不要烦啊

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3楼2012-05-22 12:50:50

youngsun50

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4楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 13:48:21:
我用的也是GE系统，聚焦是1万伏，8000也用过，差不多。
我处理的样品是细胞系，PBS清洗后离心，吸干液体后倒扣在吸水纸上面一会，然后再加裂解液的。没有特别的除盐步骤。
DTT和IPG buffer加多了会影响电泳，还是

聚焦vhrs太长没事吧，我看说明书只有30k左右？
我的菌体用10mM trish,5mM 醋酸镁清洗的
另外裂解液水化液的DTT和IPG buffer不同，最后用水化液调整各样品浓度吧，但应该最后的DTT和IPG buffer还是比规定的水化液的高吧

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5楼2012-05-22 14:02:39

youngsun50

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6楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 15:32:24:
理论上来说，聚焦时间长了会导致蛋白漂移，聚焦过度。
但你的上样量比较大。我头像就是250ug蛋白，聚焦5万vhrs银染的结果。
调样品浓度用裂解液调，水化液就管水化用。

那你最后上样样品溶液的DTT和IPG buffer就是跟裂解液一样的？

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7楼2012-05-22 15:36:16

youngsun50

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8楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 16:55:59:
上样的时候用水化液啊。样品混到水化液中，总体积450ul。
样品的体积相对水化液来说较小，所以终浓度和水化液差不多。

哦，那你的样品浓度应该很大啊，我的一般才7-10ug/ul，所以即使用水化稀释，其中的DTT和IPG buffer也会偏高

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9楼2012-05-22 21:22:50

youngsun50

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6楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 15:32:24
理论上来说，聚焦时间长了会导致蛋白漂移，聚焦过度。
但你的上样量比较大。我头像就是250ug蛋白，聚焦5万vhrs银染的结果。
调样品浓度用裂解液调，水化液就管水化用。...

你好，谢谢你上次的帮助，这次又做了一遍，还是不理想，希望你有空再指点一下：
1）我的page胶重新换了所用的母液，并且确定tris ph正确，试制了一次10%的还是容易破，试制了次12.5%(4h凝固后，没有上胶条电泳，直接拆下操作)，没有破感觉韧性挺好。但到我正式做的时候（凝固过夜），用水饱和正丁醇封胶了但胶面中间高出，请问封胶时用把倒胶的凹槽处也封死吗，我之前封死也没这个影响啊，正丁醇的量没影响吧。电泳拆下后发现还是容易破，纠结啊，是不是凝固室温放置时间长了也不好啊？
2）结果不理想，还是横条纹严重，具体条件如下。
样品制备：收集菌体，10mMtris, 5mM醋酸镁洗涤，后菌体湿重300mg加入了1ml的裂解液（尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM, IPG buffer2%，并加 PMSF），超声破碎，离心18000g,1.5h，后进行了超滤除盐，大约将原盐浓度降低了100倍。定量为20ug/ul，取30ul加入了500ul水化液（尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT18.2mM,IPGbuffer 0.5%）中，水化上样量大约500ug。
IEF条件为：30v,step,20v; 200v,grad,2h; 500v,grad,2h; 1000v,grad,5h; 10000v,grad,3h; 10000v,step,10万Vh; 1000v,step,hold。结果显示电流在聚焦10000v进行约6h后就降至了15uA,在之后的4h内电流基本未变（听工程师说电流降至20uA才算聚焦可以，之前两次都没有达到，这次至少说明除盐效果有了），我在1000v 4h之后才开始进行平衡二维电泳。电流检测（电压与设置的一样）及电泳结果如附件：
请问：为什么还有横条纹呢，是我聚焦过了吗（看说明书写聚焦过了也会产生横条纹）？10000v过高？还是1000vhold的时候有可能再次扩散了？
谢谢

电泳结果，左正右负，ph3-10,24cm,12.5%PAGE胶

电流检测结果

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10楼2012-06-24 12:40:53

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11楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-06-25 21:03:51
1：胶的问题我也不清楚是怎么回事，我制的时候是凝过夜的，用水饱和正丁醇封，覆盖保鲜膜，约1～2h后补加一些去离子水在上面。很少见胶脆。胶中部心电图样的纹说明凝的不好。要不选用更好的试剂？我用的是Sigma的产 ...

谢谢！
1）封胶时，水饱和正丁醇的量不严格吧，我一块胶封了2-3ml,而且倒胶凹槽处也加了2ml，这个有影响吗？我胶面中间突出了。那个胶中间心电图应该是气泡引起的，制胶时中间出现了三个气泡。
2）我那个程序是采用GE工程师给的，时间延长是因为要过夜到早晨，1000v hold 此步也是如此。能把你常用的程序列一下吗，参照一下。
另外，还有就是我的低熔点琼脂糖封胶时，凝固二十分钟后有点凝了，但还是很“水”的样子，你的也这样吗

谢谢

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12楼2012-06-25 21:46:52