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youngsun50

木虫 (正式写手)

[求助] 双向电泳换IPG胶条横条纹严重

各位虫友,我的样品是G-细菌,之前用PH3-10的胶条跑过,结果还可以,蛋白密集在4-7之间,但换了PH4-7的胶条后,做了两次均横条纹严重,尤其是正极端。这三次的样品处理大致相同:超声破碎10min后,DNA琼脂糖电泳检测大多碎片都集中在150bp之下,超滤管除盐大约盐分稀释了80倍(过程中样品都是在裂解液的,pH3-10的那次稀释100倍)。水化上样,3-10上样500ug,4-7上样800ug,上样前均离心除不溶物。
IEF程序为:
    1 step 30v     12h;
      2 step 200v    1h;
      3 step 500v    1h;
      4 grad 1000v  1h;
      5 grad 8000v  2h;
      6 step 8000v   hold(手动停止,-76保存)
其中3-10的那次8000v运行了85kVh,电流检测有明显降低;
    4-7的第一次8000v运行了102kVh,电流检测变化甚微,从30/31uA微降至27/8uA;
    4-7第二次8000v运行了86kVh,电流检测变化甚微,从23/24uA微降至18/19uA
      PAGE胶为12.5%
      电泳程序相同
请问:怎么4-7的聚焦这么差啊,尤其正极端,虽说3-10的正极端也有条纹但也不至于范围这么大啊?苦恼中
PS:三次电泳图如附件

3-10 + - 24cm.jpg



4-7第二次+ - 24cm.jpg



4-7第一次+ - 24cm.jpg

[ Last edited by youngsun50 on 2012-9-1 at 00:13 ]
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学会感恩,强大自我
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lanziliuli

银虫 (小有名气)

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感谢参与,应助指数 +1
youngsun50: 金币+1 2012-09-04 16:03:59
聚焦100000vhr看看效果,我们做的一般这么做条纹没有这么严重
做好科研
2楼2012-09-03 13:55:59
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youngsun50

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lanziliuli at 2012-09-03 13:55:59
聚焦100000vhr看看效果,我们做的一般这么做条纹没有这么严重

我第一次ph4-7的就聚焦了10万Vh,但结果还是这么差,你做过4-7的吗,听说不是比3-10的好聚焦吗
学会感恩,强大自我
3楼2012-09-03 14:35:21
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uneei

金虫 (小有名气)

借贵宝地问一下,双向电泳图跑成什么样,才算好的图,成功的图?希望有经验的人士指点,能附上图更好~~
4楼2012-09-03 14:38:54
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lanziliuli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


youngsun50: 金币+1 2012-09-04 16:04:18
两种都做过,不过没这么严重的横条纹,可能盐离子干扰,DTT和尿素的浓度是多少啊,低的话也可能出现这种情况
做好科研
5楼2012-09-04 15:32:26
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lanziliuli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
youngsun50: 金币+5 2012-09-04 16:04:29
关于横条纹的资料上传不上去
做好科研
6楼2012-09-04 15:47:20
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youngsun50

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by lanziliuli at 2012-09-04 15:32:26
两种都做过,不过没这么严重的横条纹,可能盐离子干扰,DTT和尿素的浓度是多少啊,低的话也可能出现这种情况

我裂解液中尿素7M,硫脲2M,DTT65mM, 水化液中尿素硫脲同前,DTT约18.2mM,即7mg/2.5ml
学会感恩,强大自我
7楼2012-09-04 16:01:17
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youngsun50

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lanziliuli at 2012-09-04 15:47:20
关于横条纹的资料上传不上去

资料大吗,不大的话能发我邮箱吗,youngsun508@163.com。另外,你们一般怎么制备样品的,除杂啥的,谢谢
学会感恩,强大自我
8楼2012-09-04 16:03:22
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lanziliuli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一般用TCA/丙酮沉淀
做好科研
9楼2012-09-07 14:30:14
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lookish

新虫 (初入文坛)

我遇到了和楼主相同的问题,3-10的跑时点集中在中间,换了4-7的跑,酸性端基本上没有点,出现了横纹,主要在高分子区,不知道楼主解决了没有,如解决亟请告知。
10楼2012-12-09 11:50:14
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