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youngsun50木虫 (正式写手)
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[求助]
双向电泳换IPG胶条横条纹严重
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各位虫友，我的样品是G-细菌，之前用PH3-10的胶条跑过，结果还可以，蛋白密集在4-7之间，但换了PH4-7的胶条后，做了两次均横条纹严重，尤其是正极端。这三次的样品处理大致相同：超声破碎10min后，DNA琼脂糖电泳检测大多碎片都集中在150bp之下，超滤管除盐大约盐分稀释了80倍（过程中样品都是在裂解液的，pH3-10的那次稀释100倍）。水化上样，3-10上样500ug，4-7上样800ug，上样前均离心除不溶物。 IEF程序为： 1 step 30v 12h; 2 step 200v 1h; 3 step 500v 1h; 4 grad 1000v 1h; 5 grad 8000v 2h; 6 step 8000v hold（手动停止，-76保存） 其中3-10的那次8000v运行了85kVh，电流检测有明显降低； 4-7的第一次8000v运行了102kVh，电流检测变化甚微，从30/31uA微降至27/8uA； 4-7第二次8000v运行了86kVh，电流检测变化甚微，从23/24uA微降至18/19uA PAGE胶为12.5% 电泳程序相同 请问：怎么4-7的聚焦这么差啊，尤其正极端，虽说3-10的正极端也有条纹但也不至于范围这么大啊？苦恼中 PS：三次电泳图如附件  3-10 + - 24cm.jpg  4-7第二次+ - 24cm.jpg  4-7第一次+ - 24cm.jpg [ Last edited by youngsun50 on 2012-9-1 at 00:13 ] |
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