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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双向电泳换IPG胶条横条纹严重
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youngsun50

木虫 (正式写手)

[求助] 双向电泳换IPG胶条横条纹严重

各位虫友，我的样品是G-细菌，之前用PH3-10的胶条跑过，结果还可以，蛋白密集在4-7之间，但换了PH4-7的胶条后，做了两次均横条纹严重，尤其是正极端。这三次的样品处理大致相同：超声破碎10min后，DNA琼脂糖电泳检测大多碎片都集中在150bp之下，超滤管除盐大约盐分稀释了80倍（过程中样品都是在裂解液的，pH3-10的那次稀释100倍）。水化上样，3-10上样500ug，4-7上样800ug，上样前均离心除不溶物。
IEF程序为：
    1 step 30v     12h;
      2 step 200v    1h;
      3 step 500v    1h;
      4 grad 1000v  1h;
      5 grad 8000v  2h;
      6 step 8000v   hold（手动停止，-76保存）
其中3-10的那次8000v运行了85kVh，电流检测有明显降低；
    4-7的第一次8000v运行了102kVh，电流检测变化甚微，从30/31uA微降至27/8uA；
    4-7第二次8000v运行了86kVh，电流检测变化甚微，从23/24uA微降至18/19uA
      PAGE胶为12.5%
      电泳程序相同
请问：怎么4-7的聚焦这么差啊，尤其正极端，虽说3-10的正极端也有条纹但也不至于范围这么大啊？苦恼中
PS：三次电泳图如附件

3-10 + - 24cm.jpg



4-7第二次+ - 24cm.jpg



4-7第一次+ - 24cm.jpg

[ Last edited by youngsun50 on 2012-9-1 at 00:13 ]
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学会感恩，强大自我
1楼 2012-08-31 23:27:59
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lanziliuli at 2012-09-04 15:32:26
两种都做过，不过没这么严重的横条纹，可能盐离子干扰，DTT和尿素的浓度是多少啊，低的话也可能出现这种情况

我裂解液中尿素7M，硫脲2M,DTT65mM, 水化液中尿素硫脲同前，DTT约18.2mM,即7mg/2.5ml
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学会感恩，强大自我
7楼2012-09-04 16:01:17
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lanziliuli

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
youngsun50: 金币+1 2012-09-04 16:03:59
聚焦100000vhr看看效果，我们做的一般这么做条纹没有这么严重
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做好科研
2楼2012-09-03 13:55:59
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lanziliuli at 2012-09-03 13:55:59
聚焦100000vhr看看效果，我们做的一般这么做条纹没有这么严重

我第一次ph4-7的就聚焦了10万Vh，但结果还是这么差，你做过4-7的吗，听说不是比3-10的好聚焦吗
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学会感恩，强大自我
3楼2012-09-03 14:35:21
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uneei

金虫 (小有名气)
借贵宝地问一下，双向电泳图跑成什么样，才算好的图，成功的图？希望有经验的人士指点，能附上图更好~~
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4楼2012-09-03 14:38:54
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