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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 双向电泳提取的蛋白质 其浓度用什么测呀？
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lws9930

至尊木虫 (职业作家)

[求助] 求助 双向电泳提取的蛋白质 其浓度用什么测呀？ 已有1人参与

各位大师，本人刚开始做双向电泳，组织用蛋白裂解液溶解后，想测其蛋白浓度，但用国产的试剂盒（BCA法）根本就测不出来啊，分光光度计都没法读数。我在测定过程中，还以蛋白裂解液也作为测定的对象，结果发现它同样与试剂盒中的反应液反应。这说明我的蛋白浓度不能用这个试剂盒测定，估计是蛋白裂解液中的某些成分与试剂盒中的东西反应了。请问你们在收集到蛋白后，都是用2D专用的进口试剂盒测定的吗？谢谢！！！
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1楼 2013-03-05 20:36:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lws9930: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-07 08:36:10
不知道你的细胞裂解液的成分，BCA试剂盒应该对常用试剂的耐受浓度有详细的说明。试试能不能变动一下裂解液中干扰定量的组分。实在不行，把样品用丙酮沉淀后再定量吧。反正IEF的样品最好除盐。
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2楼2013-03-06 07:43:36
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darkarrow

新虫 (初入文坛)
你应该是组织裂解后，TCA-acetone沉淀，干燥后加入2D rehydration buffer溶解样品，离心取上清，再用BCA测吧，标准曲线的BSA同样要用rehydration buffer 溶解，否则不准
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3楼2013-03-06 22:56:40
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lws9930

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:43:36
不知道你的细胞裂解液的成分，BCA试剂盒应该对常用试剂的耐受浓度有详细的说明。试试能不能变动一下裂解液中干扰定量的组分。实在不行，把样品用丙酮沉淀后再定量吧。反正IEF的样品最好除盐。

裂解液成分：7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，40mM Tris，40mM DTT，2% IPG buffer。看相关资料，说是DTT对试剂盒中的铜粒子有严重影响。再查查资料吧，谢谢你了！！！
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4楼2013-03-07 08:45:04
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lws9930

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by darkarrow at 2013-03-06 22:56:40
你应该是组织裂解后，TCA-acetone沉淀，干燥后加入2D rehydration buffer溶解样品，离心取上清，再用BCA测吧，标准曲线的BSA同样要用rehydration buffer 溶解，否则不准

嗯，昨天先做了个预实验，估摸着加了个样，今天染色看看结果吧。我也再查查资料。谢谢！！！
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5楼2013-03-07 08:53:57
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lws9930

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:43:36
不知道你的细胞裂解液的成分，BCA试剂盒应该对常用试剂的耐受浓度有详细的说明。试试能不能变动一下裂解液中干扰定量的组分。实在不行，把样品用丙酮沉淀后再定量吧。反正IEF的样品最好除盐。

追问一下，请问你在做双向电泳时，等电聚焦前一般是让胶面与蛋白接触后溶胀多久比较合适？？？
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6楼2013-03-07 09:05:01
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lws9930: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-03-07 10:56:20
利用考马斯亮蓝法，或者试剂盒都可以啊
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7楼2013-03-07 09:27:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by lws9930 at 2013-03-07 09:05:01
追问一下，请问你在做双向电泳时，等电聚焦前一般是让胶面与蛋白接触后溶胀多久比较合适？？？...

我一般是在低电压下rehydrate 12小时。
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8楼2013-03-07 09:58:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by lws9930 at 2013-03-07 08:45:04
裂解液成分：7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，40mM Tris，40mM DTT，2% IPG buffer。看相关资料，说是DTT对试剂盒中的铜粒子有严重影响。再查查资料吧，谢谢你了！！！...

BCA发对一些还原剂比较敏感。应该有其它方法对DTT不敏感的。
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9楼2013-03-07 10:00:35
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darkarrow

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lws9930: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-07 17:01:10
引用回帖:
5楼: Originally posted by lws9930 at 2013-03-07 08:53:57
嗯，昨天先做了个预实验，估摸着加了个样，今天染色看看结果吧。我也再查查资料。谢谢！！！...

还有一种比较tricky的方法就是rehydration溶解后的样品，泡个SDS-PAGE，然后可以normlize上杨量，如果要相对定量的话，可以同时泡个已知浓度的BSA，然后比较intensity
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10楼2013-03-07 11:44:22
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