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lws9930

至尊木虫 (职业作家)

[求助] 求助 双向电泳提取的蛋白质 其浓度用什么测呀? 已有1人参与

各位大师,本人刚开始做双向电泳,组织用蛋白裂解液溶解后,想测其蛋白浓度,但用国产的试剂盒(BCA法)根本就测不出来啊,分光光度计都没法读数。我在测定过程中,还以蛋白裂解液也作为测定的对象,结果发现它同样与试剂盒中的反应液反应。这说明我的蛋白浓度不能用这个试剂盒测定,估计是蛋白裂解液中的某些成分与试剂盒中的东西反应了。请问你们在收集到蛋白后,都是用2D专用的进口试剂盒测定的吗?谢谢!!!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lws9930: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-07 08:36:10
不知道你的细胞裂解液的成分,BCA试剂盒应该对常用试剂的耐受浓度有详细的说明。试试能不能变动一下裂解液中干扰定量的组分。实在不行,把样品用丙酮沉淀后再定量吧。反正IEF的样品最好除盐。
2楼2013-03-06 07:43:36
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darkarrow

新虫 (初入文坛)

你应该是组织裂解后,TCA-acetone沉淀,干燥后加入2D rehydration buffer溶解样品,离心取上清,再用BCA测吧,标准曲线的BSA同样要用rehydration buffer 溶解,否则不准
3楼2013-03-06 22:56:40
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lws9930

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:43:36
不知道你的细胞裂解液的成分,BCA试剂盒应该对常用试剂的耐受浓度有详细的说明。试试能不能变动一下裂解液中干扰定量的组分。实在不行,把样品用丙酮沉淀后再定量吧。反正IEF的样品最好除盐。

裂解液成分:7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,40mM Tris,40mM DTT,2% IPG buffer。看相关资料,说是DTT对试剂盒中的铜粒子有严重影响。再查查资料吧,谢谢你了!!!
4楼2013-03-07 08:45:04
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lws9930

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by darkarrow at 2013-03-06 22:56:40
你应该是组织裂解后,TCA-acetone沉淀,干燥后加入2D rehydration buffer溶解样品,离心取上清,再用BCA测吧,标准曲线的BSA同样要用rehydration buffer 溶解,否则不准

嗯,昨天先做了个预实验,估摸着加了个样,今天染色看看结果吧。我也再查查资料。谢谢!!!
5楼2013-03-07 08:53:57
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lws9930

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-06 07:43:36
不知道你的细胞裂解液的成分,BCA试剂盒应该对常用试剂的耐受浓度有详细的说明。试试能不能变动一下裂解液中干扰定量的组分。实在不行,把样品用丙酮沉淀后再定量吧。反正IEF的样品最好除盐。

追问一下,请问你在做双向电泳时,等电聚焦前一般是让胶面与蛋白接触后溶胀多久比较合适???
6楼2013-03-07 09:05:01
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追梦的人1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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lws9930: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-03-07 10:56:20
利用考马斯亮蓝法,或者试剂盒都可以啊
7楼2013-03-07 09:27:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by lws9930 at 2013-03-07 09:05:01
追问一下,请问你在做双向电泳时,等电聚焦前一般是让胶面与蛋白接触后溶胀多久比较合适???...

我一般是在低电压下rehydrate 12小时。
8楼2013-03-07 09:58:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by lws9930 at 2013-03-07 08:45:04
裂解液成分:7M尿素,2M硫脲,4%CHAPS,40mM Tris,40mM DTT,2% IPG buffer。看相关资料,说是DTT对试剂盒中的铜粒子有严重影响。再查查资料吧,谢谢你了!!!...

BCA发对一些还原剂比较敏感。应该有其它方法对DTT不敏感的。
9楼2013-03-07 10:00:35
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darkarrow

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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lws9930: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-07 17:01:10
引用回帖:
5楼: Originally posted by lws9930 at 2013-03-07 08:53:57
嗯,昨天先做了个预实验,估摸着加了个样,今天染色看看结果吧。我也再查查资料。谢谢!!!...

还有一种比较tricky的方法就是rehydration溶解后的样品,泡个SDS-PAGE,然后可以normlize上杨量,如果要相对定量的话,可以同时泡个已知浓度的BSA,然后比较intensity
10楼2013-03-07 11:44:22
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