2楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 10:34:52:
TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。
超滤除盐没做过。
楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。
胶条的选择，初次跑

3楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-05-22 12:50:50:
谢谢！
10万vhrs?那你的电压是8kv吗，我用的GE系统，说用strip holder是最大电压8k。我的裂解液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM,未加IPG buffer; 水化液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%DTT18.2mM,IPGbuffer 约1.3%

4楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 13:48:21:
我用的也是GE系统，聚焦是1万伏，8000也用过，差不多。
我处理的样品是细胞系，PBS清洗后离心，吸干液体后倒扣在吸水纸上面一会，然后再加裂解液的。没有特别的除盐步骤。
DTT和IPG buffer加多了会影响电泳，还是

5楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-05-22 14:02:39:
聚焦vhrs太长没事吧，我看说明书只有30k左右？
我的菌体用10mM trish,5mM 醋酸镁清洗的
另外裂解液水化液的DTT和IPG buffer不同，最后用水化液调整各样品浓度吧，但应该最后的DTT和IPG buffer还是比规定的水化液

6楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 15:32:24:
理论上来说，聚焦时间长了会导致蛋白漂移，聚焦过度。
但你的上样量比较大。我头像就是250ug蛋白，聚焦5万vhrs银染的结果。
调样品浓度用裂解液调，水化液就管水化用。

7楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-05-22 15:36:16:
那你最后上样样品溶液的DTT和IPG buffer就是跟裂解液一样的？

8楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 16:55:59:
上样的时候用水化液啊。样品混到水化液中，总体积450ul。
样品的体积相对水化液来说较小，所以终浓度和水化液差不多。

6楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 15:32:24
理论上来说，聚焦时间长了会导致蛋白漂移，聚焦过度。
但你的上样量比较大。我头像就是250ug蛋白，聚焦5万vhrs银染的结果。
调样品浓度用裂解液调，水化液就管水化用。...