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学会感恩，强大自我

1楼2012-05-10 17:38:20

Rubisco580

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【答案】应助回帖

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youngsun50: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-06-24 12:27:58

引用回帖:

5楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-05-22 14:02:39:
聚焦vhrs太长没事吧，我看说明书只有30k左右？
我的菌体用10mM trish,5mM 醋酸镁清洗的
另外裂解液水化液的DTT和IPG buffer不同，最后用水化液调整各样品浓度吧，但应该最后的DTT和IPG buffer还是比规定的水化液

理论上来说，聚焦时间长了会导致蛋白漂移，聚焦过度。
但你的上样量比较大。我头像就是250ug蛋白，聚焦5万vhrs银染的结果。
调样品浓度用裂解液调，水化液就管水化用。

6楼2012-05-22 15:32:24

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Rubisco580

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youngsun50: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-22 12:52:18
silicare: BioEPI+1, 应助指数+1 2012-05-22 15:24:14

TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。
超滤除盐没做过。
楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。
胶条的选择，初次跑摸条件肯定要用宽范围的，找到感兴趣的蛋白再用窄范围的。
胶破碎问题，一般情况下胶是比较有韧性的，不很容易裂，拿的时候小心就是。如果胶很脆，考虑缓冲液的pH是否正常。制备好的胶最好马上用，保存的话要保鲜膜包好，加水或者胶buffer。不包的话很快就干了。
希望对你有用。

2楼2012-05-22 10:34:52

youngsun50

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引用回帖:

2楼: Originally posted by Rubisco580 at 2012-05-22 10:34:52:
TCA丙酮沉淀丢蛋白比较厉害，除盐效果应该还行。楼主这个上样量，我在跑的时候要聚焦10万vhrs。
超滤除盐没做过。
楼主的裂解液含盐很多吗？为什么用TCA丙酮沉淀了？没做过G-细菌，不很了解。
胶条的选择，初次跑

谢谢！
10万vhrs?那你的电压是8kv吗，我用的GE系统，说用strip holder是最大电压8k。我的裂解液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM,未加IPG buffer; 水化液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%DTT18.2mM,IPGbuffer 约1.3%。请问那你一般怎么处理样品，不用除盐吗，我做了未除盐处理的条纹更严重,你TCA丙酮沉淀后条纹没用吗?
另我水化液中DTT，IPG buffer比规定的多些，影响大吗？
另，最后染色是一块胶一个托盘摇吗
新手问题有点多，希望不要烦啊

学会感恩，强大自我

3楼2012-05-22 12:50:50

Rubisco580

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3楼: Originally posted by youngsun50 at 2012-05-22 12:50:50:
谢谢！
10万vhrs?那你的电压是8kv吗，我用的GE系统，说用strip holder是最大电压8k。我的裂解液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%，DTT65mM,未加IPG buffer; 水化液为尿素7M，硫脲2M，CHAPS4%DTT18.2mM,IPGbuffer 约1.3%

我用的也是GE系统，聚焦是1万伏，8000也用过，差不多。
我处理的样品是细胞系，PBS清洗后离心，吸干液体后倒扣在吸水纸上面一会，然后再加裂解液的。没有特别的除盐步骤。
DTT和IPG buffer加多了会影响电泳，还是悠着点。
染色的时候是一块胶一个托盘。

4楼2012-05-22 13:48:21