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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TCA/丙酮沉淀，蛋白为什么不溶呢？？
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hrjxx

新虫 (小有名气)

[求助] TCA/丙酮沉淀，蛋白为什么不溶呢？？

大家好，我用0.2%DTT,10%TCA的丙酮溶液沉淀蛋白后，为什么蛋白就是不溶呢？？一直是离心后的那种块状，不能被溶解开啊，大家知道是什么原因吗？？我的裂解液成分是：9M尿素，1%DTT,4%CHAPS,0.2%CA,沉淀后干燥12分钟，室温溶解了6个小时候，还是块状，大家指教下啊!
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1楼 2011-10-16 02:32:13
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hf2016

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-16 10:53:05
hrjxx(金币+2): 谢谢啊 ，你们一般干燥多长时间啊 ？？ 2011-10-16 16:57:50
干燥时间太长，一般干燥是沉淀为半透明状就可以了
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一切开始于结束之后
2楼2011-10-16 07:29:43
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蕾雷

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3): 鼓励应助！ 2011-10-16 10:52:46
hrjxx(金币+2): 谢谢啊，离心转速低了，会不会蛋白沉淀不完全啊 ？ 2011-10-16 16:59:36
丙酮沉淀完 离心的转速不要太高  离心的时间不要太长 能把上清去除就行，干燥的时候 注意不要时间很长 另外 你的裂解液 可以放2m 硫脲
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3楼2011-10-16 09:06:24
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hrjxx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蕾雷 at 2011-10-16 09:06:24:
丙酮沉淀完 离心的转速不要太高  离心的时间不要太长 能把上清去除就行，干燥的时候 注意不要时间很长 另外 你的裂解液 可以放2m 硫脲

伯乐说明上，推荐我们的是35000G了 ，别的好像都是小于20000G的
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4楼2011-10-16 20:00:19
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求索寻觅

金虫 (小有名气)
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-10-16 23:35:19
楼主提取的是植物蛋白还是动物蛋白呢？我前段时间搞动物蛋白试了TCA/丙酮的方法除盐，后面蛋白也溶液不了，师兄让我用超声震荡的仪器搞的溶解了，后来聚焦电压上不去，我就放弃了这方法。
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5楼2011-10-16 21:46:09
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hrjxx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 求索寻觅 at 2011-10-16 21:46:09:
楼主提取的是植物蛋白还是动物蛋白呢？我前段时间搞动物蛋白试了TCA/丙酮的方法除盐，后面蛋白也溶液不了，师兄让我用超声震荡的仪器搞的溶解了，后来聚焦电压上不去，我就放弃了这方法。

我提的是动物肌肉蛋白啊
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6楼2011-10-17 02:02:48
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求索寻觅

金虫 (小有名气)
★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-10-17 18:47:59
引用回帖:
6楼: Originally posted by hrjxx at 2011-10-17 02:02:48:
我提的是动物肌肉蛋白啊

我觉得不要用TCA法，我现在直接用7M尿素，2M硫尿的方法，离心35000g（我们实验室达不到40000g或者100000g）4度离心60min，聚焦电压也可以达到7000v，我觉得应该没什么很大问题。
我现在也在做预实验，我的聚焦没什么问题了，但是第二向效果不佳，要么有横纹，要么点有拖尾，很苦恼呢。
ps：我提的动物肝脏蛋白，多多交流。
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7楼2011-10-17 18:44:55
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hrjxx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 求索寻觅 at 2011-10-17 18:44:55:
我觉得不要用TCA法，我现在直接用7M尿素，2M硫尿的方法，离心35000g（我们实验室达不到40000g或者100000g）4度离心60min，聚焦电压也可以达到7000v，我觉得应该没什么很大问题。
我现在也在做预实验，我的聚焦没 ...

好啊，多谢了 啊，我随时通报我的提取情况啊
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8楼2011-10-17 20:10:25
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dllsir

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
wanhscn(金币+5): 鼓励新虫发贴！ 2011-10-20 22:20:57
有谁跑过植物（或蓝藻)的总膜蛋白没，我提取总膜后，用普通的SDS上样缓冲液制样，跑出的带很少，而且里面含有很多色素，不知道如何去除里面的色素，还有上清TCA沉淀后跑出的条带还没有直接制样跑出的效果好？
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9楼2011-10-20 21:44:33
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hrjxx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 求索寻觅 at 2011-10-17 18:44:55:
我觉得不要用TCA法，我现在直接用7M尿素，2M硫尿的方法，离心35000g（我们实验室达不到40000g或者100000g）4度离心60min，聚焦电压也可以达到7000v，我觉得应该没什么很大问题。
我现在也在做预实验，我的聚焦没 ...

加硫脲的话，有时候会出现条纹，原因不明哦
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10楼2011-10-23 22:47:02
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