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childchou

银虫 (小有名气)


[交流] 目的片段换了酶切位点后连不上T载体了

克隆的一个2000bp的片段,之前加的酶切位点是F:HIndIII,R:BamHI,连T载之后测序正确,因为这个片段还要连上其他载体,所以又换了另外两个酶切位点,F:ECoRI,R:SacI,然后就再也没连上了。。。用的高保真酶扩增,然后加A尾,转化的板子都长了的,可是菌液PCR没有目的片段,求教!!!
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childchou

银虫 (小有名气)


引用回帖:
15楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-12-18 14:50:57
加A用的TAQ酶?
那个的话72度30min加A。

对的啊,就是30min,哭了都
16楼2014-12-18 16:34:19
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甲方不怕乙方

木虫 (正式写手)


★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-17 19:50:25
那就是假阳性了 重新制作引物试试

[ 发自小木虫客户端 ]
12楼2014-12-17 11:49:32
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906868558

新虫 (初入文坛)


★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-17 19:50:32
现在不都用无缝克隆的方法了么,不受酶切位点的限制,阳性率能达到90%以上吧。
13楼2014-12-17 16:03:29
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gangouyang

金虫 (小有名气)


★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-17 19:50:38
加A加得不够吧,延长时间,再试试看。
14楼2014-12-17 18:27:09
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