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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 目的片段换了酶切位点后连不上T载体了
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childchou

银虫 (小有名气)

[交流] 目的片段换了酶切位点后连不上T载体了

克隆的一个2000bp的片段，之前加的酶切位点是F:HIndIII,R:BamHI,连T载之后测序正确，因为这个片段还要连上其他载体，所以又换了另外两个酶切位点，F:ECoRI,R:SacI,然后就再也没连上了。。。用的高保真酶扩增，然后加A尾，转化的板子都长了的，可是菌液PCR没有目的片段，求教！！！
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1楼 2014-12-17 09:56:45
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childchou

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by 鬼羽帝魂 at 2014-12-18 14:50:57
加A用的TAQ酶？
那个的话72度30min加A。

对的啊，就是30min，哭了都
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16楼2014-12-18 16:34:19
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甲方不怕乙方

木虫 (正式写手)
★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-17 19:50:25
那就是假阳性了 重新制作引物试试

[ 发自小木虫客户端 ]
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12楼2014-12-17 11:49:32
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906868558

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-17 19:50:32
现在不都用无缝克隆的方法了么，不受酶切位点的限制，阳性率能达到90%以上吧。
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13楼2014-12-17 16:03:29
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gangouyang

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-17 19:50:38
加A加得不够吧，延长时间，再试试看。
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14楼2014-12-17 18:27:09
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