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生技101

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增基因已有3人参与

最近,在做PCR扩增目的基因,1212bp长度。设计的上游引物加有酶切位点和标签序列,送测序合成的时候,引物的退火温度,公司给计算的也包括酶切位点和标签序列在内,但是那个不会和模板特异性结合啊?还有就是做的时候,有的时候扩增的出来,但是都是呈现弥散状,甚至没有目的条带。而有时干脆就没有条带,是什么原因呢?一直也没有弄明白。求虫友的解答,不甚感激!!!
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Mis_Q

银虫 (小有名气)

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-17 11:31:59
我是引物本来扩增效率就不高,加了酶切位点完全没有产物,基本都是非特异性小片段。最近一直在摸索,昨天把那个位置的胶回收下来,准备再试试,还是不行的话就要考虑换引物了。一起加油!
8楼2014-12-17 09:23:34
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狮子山下君

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-12-12 18:47:18
可以做一个梯度PCR,摸索一下退火温度!

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2楼2014-12-12 18:25:19
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生技101

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 狮子山下君 at 2014-12-12 18:25:19
可以做一个梯度PCR,摸索一下退火温度!

做过PCR,从58到63度,但是结果也是不好。

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-12-12 20:49:05
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-17 11:31:51
首先确定引物是合适的,其次就要看PCR的体系,模板浓度不能太高,引物浓度也要低一点,否则会有引物二聚体,温度可以再降,不管有无杂带,先把目的基因P出来,然后把目的基因切胶回收,再以这个为模板做扩增,如果还是不行,试着加点DMSO试试
医学&统计学
4楼2014-12-14 12:42:40
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生技101

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 董博士 at 2014-12-14 12:42:40
首先确定引物是合适的,其次就要看PCR的体系,模板浓度不能太高,引物浓度也要低一点,否则会有引物二聚体,温度可以再降,不管有无杂带,先把目的基因P出来,然后把目的基因切胶回收,再以这个为模板做扩增,如果还 ...

嗯嗯,谢谢

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-12-14 17:39:26
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 生技101 at 2014-12-14 17:39:26
嗯嗯,谢谢
...

我做了几天,也都是这样子,打算做条件的优化
6楼2014-12-15 20:42:43
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生技101

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2014-12-15 20:42:43
我做了几天,也都是这样子,打算做条件的优化...

嗯嗯,加油

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7楼2014-12-16 10:30:03
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by Mis_Q at 2014-12-17 09:23:34
我是引物本来扩增效率就不高,加了酶切位点完全没有产物,基本都是非特异性小片段。最近一直在摸索,昨天把那个位置的胶回收下来,准备再试试,还是不行的话就要考虑换引物了。一起加油!

我改的模板是oligo DT,然后就出来了… 之前是随机引物做的pcr。

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9楼2014-12-18 15:35:29
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生技101

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2014-12-18 15:35:29
我改的模板是oligo DT,然后就出来了… 之前是随机引物做的pcr。...

我的也是,但是就是扩增不出来,现在没有再做PCR,但是觉得以后那肯定还是个问题

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10楼2014-12-18 18:23:16
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