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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增基因
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生技101

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增基因 已有3人参与

最近，在做PCR扩增目的基因，1212bp长度。设计的上游引物加有酶切位点和标签序列，送测序合成的时候，引物的退火温度，公司给计算的也包括酶切位点和标签序列在内，但是那个不会和模板特异性结合啊？还有就是做的时候，有的时候扩增的出来，但是都是呈现弥散状，甚至没有目的条带。而有时干脆就没有条带，是什么原因呢？一直也没有弄明白。求虫友的解答，不甚感激！！！
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1楼 2014-12-12 15:00:39
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Mis_Q

银虫 (小有名气)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-17 11:31:59
我是引物本来扩增效率就不高，加了酶切位点完全没有产物，基本都是非特异性小片段。最近一直在摸索，昨天把那个位置的胶回收下来，准备再试试，还是不行的话就要考虑换引物了。一起加油！
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8楼2014-12-17 09:23:34
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普通回帖

狮子山下君

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-12-12 18:47:18
可以做一个梯度PCR，摸索一下退火温度！

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2楼2014-12-12 18:25:19
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生技101

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 狮子山下君 at 2014-12-12 18:25:19
可以做一个梯度PCR，摸索一下退火温度！

做过PCR，从58到63度，但是结果也是不好。

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3楼2014-12-12 20:49:05
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-12-17 11:31:51
首先确定引物是合适的，其次就要看PCR的体系，模板浓度不能太高，引物浓度也要低一点，否则会有引物二聚体，温度可以再降，不管有无杂带，先把目的基因P出来，然后把目的基因切胶回收，再以这个为模板做扩增，如果还是不行，试着加点DMSO试试
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医学&统计学
4楼2014-12-14 12:42:40
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生技101

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 董博士 at 2014-12-14 12:42:40
首先确定引物是合适的，其次就要看PCR的体系，模板浓度不能太高，引物浓度也要低一点，否则会有引物二聚体，温度可以再降，不管有无杂带，先把目的基因P出来，然后把目的基因切胶回收，再以这个为模板做扩增，如果还 ...

嗯嗯，谢谢

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5楼2014-12-14 17:39:26
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 生技101 at 2014-12-14 17:39:26
嗯嗯，谢谢
...

我做了几天，也都是这样子，打算做条件的优化
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6楼2014-12-15 20:42:43
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生技101

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2014-12-15 20:42:43
我做了几天，也都是这样子，打算做条件的优化...

嗯嗯，加油

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7楼2014-12-16 10:30:03
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键盘上的脚丫

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Mis_Q at 2014-12-17 09:23:34
我是引物本来扩增效率就不高，加了酶切位点完全没有产物，基本都是非特异性小片段。最近一直在摸索，昨天把那个位置的胶回收下来，准备再试试，还是不行的话就要考虑换引物了。一起加油！

我改的模板是oligo DT，然后就出来了… 之前是随机引物做的pcr。
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生技101
9楼2014-12-18 15:35:29
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生技101

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 键盘上的脚丫 at 2014-12-18 15:35:29
我改的模板是oligo DT，然后就出来了… 之前是随机引物做的pcr。...

我的也是，但是就是扩增不出来，现在没有再做PCR，但是觉得以后那肯定还是个问题

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10楼2014-12-18 18:23:16
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