应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 基因组DNA模板质量对PCR有什么影响
141/1返回列表
查看: 4677  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[交流] 基因组DNA模板质量对PCR有什么影响

各位亲 基因组DNA模板进行PCR扩增时，其质量对其有什么影响？我提取的基因组DNA跑电泳，只出现一条细细规则的条带，感觉t提的还挺不错的，但测浓度纯度的时候，OD260/OD280比值却大于2，有的甚至是3或4，提取的时候加入了RNase，电泳也没看到RNA条带，用这样的基因组DNA扩增PCR，扩增不出目的条带，各位大神帮忙分析一下吧  谢谢啦

[ Last edited by silicare on 2014-2-19 at 11:33 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2013-12-30 19:29:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mzhyan

至尊木虫 (文坛精英)
★
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
blessing
回复此楼
2楼2013-12-30 19:56:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-31 12:45:50
PCR对基因组模板的纯度要求不高，通常含有少量盐、蛋白或者RNA都可以用。OD260/280过高，超过2，可能是核酸仪出了问题。如果跑电泳条带中无RNA，应该不是RNA的问题了。如果P不出来，可能有很多原因，模板用量是否正确？（跑电泳可见，说明浓度还不错，需要稀释后再P）。引物的退火温度选得是否合适？PCR体系建立是否有问题等。
赞一下 回复此楼
6楼2013-12-31 01:50:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-31 01:50:40
PCR对基因组模板的纯度要求不高，通常含有少量盐、蛋白或者RNA都可以用。OD260/280过高，超过2，可能是核酸仪出了问题。如果跑电泳条带中无RNA，应该不是RNA的问题了。如果P不出来，可能有很多原因，模板用量是否正 ...

我先在遇到一个相当让我捉摸不透的问题，同样的引物，体系也一样，只是模板不一样，却有的在64度退火温度能P出目的条带，有的在56度能P出目的条带，请问这是什么原因造成的呢
赞一下 回复此楼
7楼2013-12-31 08:20:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-31 14:15:33
引用回帖:
7楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-31 08:20:10
我先在遇到一个相当让我捉摸不透的问题，同样的引物，体系也一样，只是模板不一样，却有的在64度退火温度能P出目的条带，有的在56度能P出目的条带，请问这是什么原因造成的呢...

是P出同样的条带吗？一对引物通常能够在较大的退火温度范围下都有不错的扩增，所以56-64°C都可以P出来的情况也是正常的。还有可能是由于模板中的盐浓度不同而造成退火温度差异。通常提gDNA的protocol里的buffer通常含有一定浓度的NaCl，如果沉淀DNA时加入了醋酸钠，都会引入高浓度的钠离子。引物的退货温度与钠离子浓度有关。
赞一下 回复此楼
8楼2013-12-31 12:58:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

achonghello

金虫 (正式写手)
★
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与

目的条带大不大？退货时间啊温度啊什么的都调调试试看。。。
赞一下 回复此楼
9楼2013-12-31 13:50:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-31 12:58:39
是P出同样的条带吗？一对引物通常能够在较大的退火温度范围下都有不错的扩增，所以56-64°C都可以P出来的情况也是正常的。还有可能是由于模板中的盐浓度不同而造成退火温度差异。通常提gDNA的protocol里的buffer通 ...

经过测序验证这两个退火温度下的目的片段是一样的，请问模板中钠离子浓度怎么控制，我用的是天根的试剂盒，不清楚里面是否加入了醋酸钠
赞一下 回复此楼
10楼2013-12-31 14:14:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-20 08:27:27
引用回帖:
10楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-31 14:14:50
经过测序验证这两个退火温度下的目的片段是一样的，请问模板中钠离子浓度怎么控制，我用的是天根的试剂盒，不清楚里面是否加入了醋酸钠...

一般不会刻意去控制钠离子浓度。如果gDNA提得好，浓度应该是可以的，而做PCR所用的模板量非常少，通常是需要稀释后用的，提前模板中的杂质往往忽略不计了。你是问可能造成的原因，我只是试着分析一下。
赞一下 回复此楼
11楼2014-01-01 00:13:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-31 01:50:40
PCR对基因组模板的纯度要求不高，通常含有少量盐、蛋白或者RNA都可以用。OD260/280过高，超过2，可能是核酸仪出了问题。如果跑电泳条带中无RNA，应该不是RNA的问题了。如果P不出来，可能有很多原因，模板用量是否正 ...

我测得的基因组DNA浓度不高，也就在20-30ng/ul左右，我25ul的体系加入2ul模板，但是有时候却P不出条带，是不是因为模板浓度太低的原因？
赞一下 回复此楼
12楼2014-02-19 11:02:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-02-19 11:02:47
我测得的基因组DNA浓度不高，也就在20-30ng/ul左右，我25ul的体系加入2ul模板，但是有时候却P不出条带，是不是因为模板浓度太低的原因？...

如果模板纯度较高，一般10ng就能有很好的PCR效果。如果纯度差，可以增加模板的用量，适当增加镁离子浓度。
赞一下 回复此楼
14楼2014-02-21 10:12:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
yingying15883楼
2013-12-30 21:33   回复  
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
flyxu4楼
2013-12-30 21:54   回复  
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
kiss200855375楼
2013-12-30 22:14   回复  
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
yingying158813楼
2014-02-19 22:38   回复  
相关版块跳转 我要订阅楼主 摩羯的心 的主题更新
141/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭