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摩羯的心

铁虫 (小有名气)

[交流] 基因组DNA模板质量对PCR有什么影响

各位亲 基因组DNA模板进行PCR扩增时，其质量对其有什么影响？我提取的基因组DNA跑电泳，只出现一条细细规则的条带，感觉t提的还挺不错的，但测浓度纯度的时候，OD260/OD280比值却大于2，有的甚至是3或4，提取的时候加入了RNase，电泳也没看到RNA条带，用这样的基因组DNA扩增PCR，扩增不出目的条带，各位大神帮忙分析一下吧  谢谢啦

[ Last edited by silicare on 2014-2-19 at 11:33 ]
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1楼 2013-12-30 19:29:56
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mzhyan

至尊木虫 (文坛精英)
★
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
blessing
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2楼2013-12-30 19:56:11
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-31 12:45:50
PCR对基因组模板的纯度要求不高，通常含有少量盐、蛋白或者RNA都可以用。OD260/280过高，超过2，可能是核酸仪出了问题。如果跑电泳条带中无RNA，应该不是RNA的问题了。如果P不出来，可能有很多原因，模板用量是否正确？（跑电泳可见，说明浓度还不错，需要稀释后再P）。引物的退火温度选得是否合适？PCR体系建立是否有问题等。
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6楼2013-12-31 01:50:40
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-31 01:50:40
PCR对基因组模板的纯度要求不高，通常含有少量盐、蛋白或者RNA都可以用。OD260/280过高，超过2，可能是核酸仪出了问题。如果跑电泳条带中无RNA，应该不是RNA的问题了。如果P不出来，可能有很多原因，模板用量是否正 ...

我先在遇到一个相当让我捉摸不透的问题，同样的引物，体系也一样，只是模板不一样，却有的在64度退火温度能P出目的条带，有的在56度能P出目的条带，请问这是什么原因造成的呢
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7楼2013-12-31 08:20:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-31 14:15:33
引用回帖:
7楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-31 08:20:10
我先在遇到一个相当让我捉摸不透的问题，同样的引物，体系也一样，只是模板不一样，却有的在64度退火温度能P出目的条带，有的在56度能P出目的条带，请问这是什么原因造成的呢...

是P出同样的条带吗？一对引物通常能够在较大的退火温度范围下都有不错的扩增，所以56-64°C都可以P出来的情况也是正常的。还有可能是由于模板中的盐浓度不同而造成退火温度差异。通常提gDNA的protocol里的buffer通常含有一定浓度的NaCl，如果沉淀DNA时加入了醋酸钠，都会引入高浓度的钠离子。引物的退货温度与钠离子浓度有关。
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8楼2013-12-31 12:58:39
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achonghello

金虫 (正式写手)
★
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与

目的条带大不大？退货时间啊温度啊什么的都调调试试看。。。
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9楼2013-12-31 13:50:13
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-31 12:58:39
是P出同样的条带吗？一对引物通常能够在较大的退火温度范围下都有不错的扩增，所以56-64°C都可以P出来的情况也是正常的。还有可能是由于模板中的盐浓度不同而造成退火温度差异。通常提gDNA的protocol里的buffer通 ...

经过测序验证这两个退火温度下的目的片段是一样的，请问模板中钠离子浓度怎么控制，我用的是天根的试剂盒，不清楚里面是否加入了醋酸钠
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10楼2013-12-31 14:14:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-02-20 08:27:27
引用回帖:
10楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2013-12-31 14:14:50
经过测序验证这两个退火温度下的目的片段是一样的，请问模板中钠离子浓度怎么控制，我用的是天根的试剂盒，不清楚里面是否加入了醋酸钠...

一般不会刻意去控制钠离子浓度。如果gDNA提得好，浓度应该是可以的，而做PCR所用的模板量非常少，通常是需要稀释后用的，提前模板中的杂质往往忽略不计了。你是问可能造成的原因，我只是试着分析一下。
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11楼2014-01-01 00:13:58
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摩羯的心

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-31 01:50:40
PCR对基因组模板的纯度要求不高，通常含有少量盐、蛋白或者RNA都可以用。OD260/280过高，超过2，可能是核酸仪出了问题。如果跑电泳条带中无RNA，应该不是RNA的问题了。如果P不出来，可能有很多原因，模板用量是否正 ...

我测得的基因组DNA浓度不高，也就在20-30ng/ul左右，我25ul的体系加入2ul模板，但是有时候却P不出条带，是不是因为模板浓度太低的原因？
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12楼2014-02-19 11:02:47
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 摩羯的心 at 2014-02-19 11:02:47
我测得的基因组DNA浓度不高，也就在20-30ng/ul左右，我25ul的体系加入2ul模板，但是有时候却P不出条带，是不是因为模板浓度太低的原因？...

如果模板纯度较高，一般10ng就能有很好的PCR效果。如果纯度差，可以增加模板的用量，适当增加镁离子浓度。
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14楼2014-02-21 10:12:48
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yingying15883楼
2013-12-30 21:33   回复  
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flyxu4楼
2013-12-30 21:54   回复  
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
kiss200855375楼
2013-12-30 22:14   回复  
摩羯的心(金币+1): 谢谢参与
yingying158813楼
2014-02-19 22:38   回复  
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