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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 怀疑提质粒时提到了杂菌的质粒，求大家给帮着分析分析
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)

[求助] 怀疑提质粒时提到了杂菌的质粒，求大家给帮着分析分析 已有2人参与

第一次提质粒之后跑了电泳，重组质粒应该是7000，没线性化跑的时候4000那有非常亮的条带，但是7000那只有隐隐约约的条带，而且某些样品点样孔发亮。虽然没线性化看不出实际大小，但大小是差不多的，不会相差3000bp这么多。我用的质粒是pEASY Blunt Simple，空质粒就是4000.
  随后我用通用引物，以质粒为模板跑了PCR，都跑出了3000的目的条带，诡异的是某些样品点样孔依然发亮。第一次跑PCR产物有这种情况。
  然后我又用EcoRI和NotI双酶切过夜，跑了电泳，能切出两条带，并且大小相符。而且没有杂带……
  我以为是我提质粒提不好，又认真的提了一次，还是和第一次一样，4000那非常亮，7000（也就是重组质粒应该在的地方）反而只有隐约的条带。
  当时觉得结果不好都没留图，烦大家看文字吧。
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1楼 2014-12-08 18:00:58
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你提的没问题，4K的是超螺旋的质粒。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-12-08 18:26:06
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
"虽然没线性化看不出实际大小，但大小是差不多的，不会相差3000bp这么多。"你的这个理解是错误的。要想通过电泳判断载体大小，有两种方法，一种是对载体进行单酶切后电泳，另一种是使用载体电泳专用marker。
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3楼2014-12-08 18:55:00
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-12-08 18:26:06
你提的没问题，4K的是超螺旋的质粒。

以前从来没有提成这样过，一直是一条带，这次除了用的不是冷冻离心机以外，其他操作都一样。会是什么因素但是超螺旋质粒这么亮呢？

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4楼2014-12-09 08:14:10
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ggyy0911

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by stone2239 at 2014-12-08 18:55:00
"虽然没线性化看不出实际大小，但大小是差不多的，不会相差3000bp这么多。"你的这个理解是错误的。要想通过电泳判断载体大小，有两种方法，一种是对载体进行单酶切后电泳，另一种是使用载体电泳专用marke ...

这算是经验之谈吧，我们没有测纯度的仪器，想看有没有蛋白残留之类，以前每次都是线性化的和质粒本身一起跑，相差很小的。

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5楼2014-12-09 08:16:33
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by ggyy0911 at 2014-12-09 08:14:10
以前从来没有提成这样过，一直是一条带，这次除了用的不是冷冻离心机以外，其他操作都一样。会是什么因素但是超螺旋质粒这么亮呢？
...

给超螺旋的质粒判断大小，理论上是不能用线型MaRKEr的，很多因素都会影响你的判断。如果你想提高提取效率，问下试剂盒的客服吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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6楼2014-12-09 08:26:16
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