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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)

[求助] 反转录后PCR扩不出目的条带已有7人参与

最近刚开始自己的实验,只有一个细胞株,想要从这个细胞株里提RNA,反转录后PCR扩出需要的目的基因序列。反转录后PCR用了GAPDH的引物做对照,GAPDH能够扩出来,但是需要的目的基因条带一直扩不出来,条带都没有。模板、引物、酶量、温度梯度都试过,一直失败中,希望大家多给指点指点,求分享经验!另外,如果我需要其他的目的基因序列,能也从这个细胞株里相同方法得到吗?谢谢
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shoufangche

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-11 16:36:04
GAPDH能够扩出来说明你的DNA模版是没有问题的,是引物序列不合适吧
2楼2014-11-11 12:27:23
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koujie1986

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-11 16:36:12
扩不出来原因有很多,需要逐步排查原因。我觉得可以考虑先找其他质量可以的cDNA看看你的引物质量如何,如果引物设计有问题怎么扩都不会有带的。其次,先弄清楚该基因在你那个细胞株里面表不表达,表达时间等等。再次,RNA提取质量要有保证,这样反转录效率才高,模板质量有保证。
3楼2014-11-11 14:49:47
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shoufangche at 2014-11-11 12:27:23
GAPDH能够扩出来说明你的DNA模版是没有问题的,是引物序列不合适吧

因为还有定量PCR的引物,就用定量PCR的引物也在普通PCR仪上试了试,也是出不来。就在想是不是提的RNA降解了,或者细胞本身表达那个蛋白还是有点少。所以打算跑胶再看看RNA,另外重新问别人要到另一个细胞株提的RNA,想一起跑胶看看再试试能不能P出来。
4楼2014-11-11 20:18:33
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by koujie1986 at 2014-11-11 14:49:47
扩不出来原因有很多,需要逐步排查原因。我觉得可以考虑先找其他质量可以的cDNA看看你的引物质量如何,如果引物设计有问题怎么扩都不会有带的。其次,先弄清楚该基因在你那个细胞株里面表不表达,表达时间等等。再次 ...

我现在资源有限,木有可用的cDNA ,所以为了获得我的基因序列才用反转录。另外一对引物订出去了。想问一下如果只是低表达是不是就很难扩出来?表达时间是怎么来判断的?O(∩_∩)O谢谢
5楼2014-11-11 20:24:04
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匿名

用户注销 (正式写手)

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6楼2014-11-12 14:13:54
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Ms_Ling

新虫 (小有名气)

7楼2014-11-12 15:06:18
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running113

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


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半岛铁盒lsf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-15 14:42:21
目的片段长度,引物,PCR程序,基因表达峰度,都有可能影响!
楼主可以试试。
最近也在扩目的带,很麻烦。

[ 发自小木虫客户端 ]
SCI我来了!!!
8楼2014-11-12 15:10:36
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wg0541001 at 2014-11-12 14:13:54
目的片段有多大呢?

2500bp
9楼2014-11-12 15:33:05
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匿名

用户注销 (正式写手)

本帖仅楼主可见
10楼2014-11-12 20:27:03
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