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duanming123

木虫 (正式写手)

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[求助] actin扩不出来？

刚反转录出的cDNA, actin扩不出来，引物没问题，用的是Mix,模板稀释了5倍，RNA质量还行，是不是模板浓度太高了，在稀释做做？大家谁遇到种问题？

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1楼2011-08-12 20:45:39

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blessed

木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-14 09:18:40
duanming123(金币+1): 5 2011-08-14 17:10:37
duanming123(金币+2): 2011-08-16 19:52:31

以20ugRNA反转录起始，一般cDNA稀释5-10倍后作为模板进行PCR扩增，大概23-26个cycle就可以。如果Primer没有问题，反转录过程也没问题，那就是PCR不work了，检查PCR所使用的各个组分有没有问题。同时也要确保你的反转录过程是好的。Actin是很容易扩的。

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2楼2011-08-14 01:55:43

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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+1): 反转录一般20Ul体系2ugRNA没问题，cdna可以电泳看 2011-08-14 09:20:42
adslye(金币+1): 鼓励交流，cdna跑电泳没意义 2011-08-14 09:22:36
duanming123(金币+1): 5 2011-08-14 17:10:49

1、RNA浓度问题，不知道你测定RNA浓度了吗？一个反转录体系RNA浓度要求在500ng以内。高了不行。超了引物浓度还怎么扩？一般我提出的总RNA，要稀释20倍以上。
2、CDNA没成，建议反转录后做个电泳看下，CDNA电泳一条带。
3、PCR时，内参相当容易出。按着说明书就能出。我分析是你前面的问题。

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3楼2011-08-14 08:43:44

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