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fyw921铜虫 (小有名气)
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【讨论】F-actin 染色中为什么染不出纤维状图片 已有4人参与
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| 大家好，请问大家在做F-actin染色时为什么染不出纤维状的图片呢，我的实验步骤是细胞种植在12孔板的细胞爬片中，培养24 h，细胞用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，0.1% triton-100渗透3 min，PBS洗3次，1%BSA非特异性吸附10min，PBS洗3次加罗丹明标记的鬼笔环肽5μl,室温染色20min。封片后共聚焦下观察，观察不到纤维状的F-actin，请大家帮忙分析一下原因。谢谢 |
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shileinjut(金币+1):谢谢积极回帖交流！ 2010-10-26 12:22:22
americanyk(金币+1):Tks for expert 2010-10-26 16:32:06
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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americanyk(金币+1):Tks for expert 2010-10-26 16:32:06
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triton 时间短了 延长到20-30min室温或者4度过夜。 穿膜后不要用pbs洗了，全部改用0.1%triton+ 1%FBS洗，可以免掉封闭的步骤。鬼笔环肽也是拿这个液体稀释。 染色和观察过程需要避光。 注意激发光波长选择。 可以先在荧光显微镜上观察一下染色效果再到共聚焦上看。pinhole开始别太小。 12孔板底太厚不便于观察，建议使用共聚焦专用的培养皿。 |
2楼2010-10-26 11:02:54
fyw921
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4楼2010-10-26 23:40:26
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