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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】芽孢染色做不出来，望高人指点
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】芽孢染色做不出来，望高人指点

我最近在做一个芽孢杆菌的芽孢染色，用的方法是先用5%孔雀绿加热染色5min，水洗，番红复染。结果是菌体全是红色， 芽孢看不出来。有些时候水洗的不够，全是绿色，红色看不出来，急需解决，望高人指点。
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1楼 2010-11-21 10:54:42
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张志超3421

金虫 (小有名气)
★
gao-feng(金币+1):谢谢参与
先抢个位，飘过
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2楼2010-11-21 12:24:25
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)
怎么没有人搭理我，我想哭。我这可是第一次求助啊
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3楼2010-11-21 17:27:21
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)
★
gao-feng(金币+1):谢谢参与
gao-feng(金币+2): 2010-11-21 20:43:02
时间太短，沸水浴20min才行。我就这样的。
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4楼2010-11-21 20:18:48
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by amisking at 2010-11-21 20:18:48:
时间太短，沸水浴20min才行。我就这样的。

能给我一个详细的实验步骤么？包括孔雀绿浓度，番红浓度等等
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5楼2010-11-21 20:44:15
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amisking

荣誉版主 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by gao-feng at 2010-11-21 20:44:15:



能给我一个详细的实验步骤么？包括孔雀绿浓度，番红浓度等等

好几年没做了，我是按照实验书上面的。
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6楼2010-11-21 20:55:26
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)
还有人做过吗，吼一声啊。我这个问题困扰了好几个月了。
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7楼2010-11-22 09:47:12
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lj206141

木虫 (正式写手)
★ ★
gao-feng(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+1):感谢交流 2010-11-22 10:56:48
孔雀绿染色可以不用加热的，
加热固定以后，孔雀绿饱和溶液室温保持10分钟，水洗（不直接冲洗到染色处），番红0.1%染色1分钟，水洗，观察。
固定的时候注意最好是自然晾干，再加热固定，如果是在火焰处烘干温度不能太高，不然影响染色效果

[ Last edited by lj206141 on 2010-11-22 at 10:24 ]
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8楼2010-11-22 10:22:25
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)
也还有高人吗？再给点建议啊
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9楼2010-11-22 15:27:07
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)
这个东西不能沉掉啊
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10楼2010-11-23 09:38:12
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dyszz

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★
gao-feng(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+5):辛苦 2010-11-23 09:49:26
gao-feng(金币+1):很详细啊，但壁纸是不是你的经验，这些方法我在实验书上见过，也照着做过，就是做不好。 2010-11-23 09:56:57
基本原理    芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。

方法1  （Schaeffer-Fulton氏染色法）
　　（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。
　　（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
　　（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。
　　（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
　　（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。
　　（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
　　注意
　　（1）选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。
　　（2）加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。
　　
方法2  （改良的Schaeffer-Fulton氏染色法）
（1）        制备菌悬液   加1-2滴水于小试管中，用接种挑取2-3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成孢囊为宜；取菌不宜太少。
（2）        染色        加孔雀绿2-3滴于小试管中，使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴烧杯中，加热染色15-20分钟。
（3）        涂片固定    用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次，温热固定。
（4）        脱色        水洗，直至流出的水无绿色为止。
（5）        复染        用番红染液染色2-3分钟，倾去染液并用滤纸吸干残液。
（6）        镜检        干燥后，用油镜观察。 芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体呈红色。
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11楼2010-11-23 09:48:13
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by lj206141 at 2010-11-22 10:22:25:
孔雀绿染色可以不用加热的，
加热固定以后，孔雀绿饱和溶液室温保持10分钟，水洗（不直接冲洗到染色处），番红0.1%染色1分钟，水洗，观察。
固定的时候注意最好是自然晾干，再加热固定，如果是在火焰处烘干温度 ...

我照着你的步骤做了，还是没有办法啊。我甚至孔雀绿饱和溶液染色过夜，一经过水洗，就没什么颜色了。
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12楼2010-12-05 09:48:12
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lj206141

木虫 (正式写手)
gao-feng(金币+3):谢谢你，你有比较详细的步骤吗 2010-12-06 09:57:42
引用回帖:
Originally posted by gao-feng at 2010-12-05 09:48:12:



我照着你的步骤做了，还是没有办法啊。我甚至孔雀绿饱和溶液染色过夜，一经过水洗，就没什么颜色了。

那你试试用石炭酸复红需加温染色然后水洗然后用稀释的美蓝液复染
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13楼2010-12-06 09:12:05
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liyang003

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不一定都能染出来，我鉴定过的一株芽孢杆菌就不怎么产芽孢，整张载玻片只有几个芽孢。也可以用生芽孢培养基培养试试。
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14楼2010-12-08 10:18:38
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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by liyang003 at 2010-12-08 10:18:38:
不一定都能染出来，我鉴定过的一株芽孢杆菌就不怎么产芽孢，整张载玻片只有几个芽孢。也可以用生芽孢培养基培养试试。

你能给我一张你染色特图片么，假如有条件的话。
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15楼2010-12-08 10:41:36
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YaYa785

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
固定时自然晾干 不用直接加热  掌握不好就看不出效果
还有 不用那么长时间  我一般都是件减半  
找本实验书看看  很详细的步骤   
很久没做过了 记不清了
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16楼2010-12-08 11:10:12
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YaYa785

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
还有就是 芽孢杆菌在培养条件不好 也就是说营养贫乏的时候才会产芽孢  这是自我保护机制 所以 染不出来的一个原因是 没有产芽孢  换一个基本培养基  多产芽孢  再染色...
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17楼2010-12-08 11:12:17
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jacketob

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们是用的结晶紫染色的看的很清楚。
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18楼2012-03-29 08:12:25
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逆风草victor

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我最近也在做芽孢杆菌染色，也没有成功，不过和你说的不是一种情况，我的样本孔雀绿已经染上颜色了，但是番红没有染上颜色，而且细菌大都不是完整的，大体总结了一下原因：
1、芽孢染色在孔雀绿染色的时候，染液都沸腾了，导致大量菌体被破坏
2、所培养的平板时间太长，芽孢杆菌都菌龄太大
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20楼2015-01-23 08:55:58
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sym2233

金虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我当时是从培养基上取一块菌落加到试管中，用几毫升蒸馏水稀释，并加上孔雀绿。将试管放到加水的烧杯中，在炉子上加热20min，然后再取一滴在载玻片上，固定，水洗，复染。菌体最好培养时间长点。
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21楼2015-01-23 09:06:01
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shengchen

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的菌培养的时间有没有注意，你试试取不同生长期的菌样来做，即选生长曲线上的几个OD点的菌样来做
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22楼2015-01-25 23:32:43
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逆风草victor19楼
2015-01-23 08:46   回复  
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