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gao-feng

铁杆木虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】芽孢染色做不出来，望高人指点

我最近在做一个芽孢杆菌的芽孢染色，用的方法是先用5%孔雀绿加热染色5min，水洗，番红复染。结果是菌体全是红色，芽孢看不出来。有些时候水洗的不够，全是绿色，红色看不出来，急需解决，望高人指点。

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1楼2010-11-21 10:54:42

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dyszz

铜虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★ ★ ★
gao-feng(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+5):辛苦 2010-11-23 09:49:26
gao-feng(金币+1):很详细啊，但壁纸是不是你的经验，这些方法我在实验书上见过，也照着做过，就是做不好。 2010-11-23 09:56:57

基本原理芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。

方法1  （Schaeffer-Fulton氏染色法）
　　（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。
　　（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
　　（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。
　　（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。
　　（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。
　　（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
　　注意
　　（1）选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。
　　（2）加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加热不够则芽孢难以着色。
　　
方法2  （改良的Schaeffer-Fulton氏染色法）
（1）制备菌悬液加1-2滴水于小试管中，用接种挑取2-3环菌苔于试管中，搅拌均匀，制成浓的菌悬液。所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成孢囊为宜；取菌不宜太少。
（2）染色       加孔雀绿2-3滴于小试管中，使其与菌液混合均匀，然后将试管置于沸水浴烧杯中，加热染色15-20分钟。
（3）涂片固定用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净载玻片上，涂成薄膜，然后将涂片通过火焰3次，温热固定。
（4）脱色       水洗，直至流出的水无绿色为止。
（5）复染       用番红染液染色2-3分钟，倾去染液并用滤纸吸干残液。
（6）镜检       干燥后，用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体呈红色。