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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 材料区 » 生物材料 » 综合其他 » 【讨论】F-actin 染色中为什么染不出纤维状图片
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fyw921

铜虫 (小有名气)

[交流] 【讨论】F-actin 染色中为什么染不出纤维状图片已有4人参与

大家好，请问大家在做F-actin染色时为什么染不出纤维状的图片呢，我的实验步骤是细胞种植在12孔板的细胞爬片中，培养24 h，细胞用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定10min。PBS洗3次，0.1% triton-100渗透3 min，PBS洗3次，1%BSA非特异性吸附10min，PBS洗3次加罗丹明标记的鬼笔环肽5μl,室温染色20min。封片后共聚焦下观察，观察不到纤维状的F-actin，请大家帮忙分析一下原因。谢谢
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1楼2010-10-26 10:48:12
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科研屌丝007

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
红舟流星: 欢迎新虫来生物材料板块交流，有问题可以开新帖询问 2014-12-08 12:08:32
请问楼主的问题是如何解决的？谢谢！最近我的实验也遇到这个问题
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8楼2014-12-08 10:36:42
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dj04164

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
shileinjut(金币+1):谢谢积极回帖交流！ 2010-10-26 12:22:22
americanyk(金币+1):Tks for expert 2010-10-26 16:32:06
triton 时间短了 延长到20-30min室温或者4度过夜。
穿膜后不要用pbs洗了，全部改用0.1%triton+ 1%FBS洗，可以免掉封闭的步骤。鬼笔环肽也是拿这个液体稀释。
染色和观察过程需要避光。
注意激发光波长选择。
可以先在荧光显微镜上观察一下染色效果再到共聚焦上看。pinhole开始别太小。
12孔板底太厚不便于观察，建议使用共聚焦专用的培养皿。
赞一下(3人) 回复此楼
2楼2010-10-26 11:02:54
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fyw921

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by dj04164 at 2010-10-26 11:02:54:
triton 时间短了 延长到20-30min室温或者4度过夜。
穿膜后不要用pbs洗了，全部改用0.1%triton+ 1%FBS洗，可以免掉封闭的步骤。鬼笔环肽也是拿这个液体稀释。
染色和观察过程需要避光。
注意激发光波长选择。
...

我是种在细胞爬片上用共聚焦观察的，爬片应该没问题，会不会是我的封闭步骤没完全封闭掉啊
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3楼2010-10-26 16:53:04
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dj04164

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
americanyk(金币+1):谢谢参与！ 2010-10-27 02:51:39
引用回帖:
Originally posted by fyw921 at 2010-10-26 16:53:04:

我是种在细胞爬片上用共聚焦观察的，爬片应该没问题，会不会是我的封闭步骤没完全封闭掉啊

封闭的意思阻止非特异性结合。封闭不完全不会看不到细胞，可能会造成本底比较高。你可以使用我上面说了的缓冲液，那个可以边封闭边穿膜。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2010-10-26 23:40:26
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