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【经验分享】体外转录踩坑无数，挖到一款好用的国产 T7 RNA 聚合酶
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各位做分子实验的虫友，不知道有没有人和我一样常年做体外转录？平时要合成 RNA 探针、反义 RNA，还经常批量做 RNAi 相关转录产物，前后换过好几种进口、国产 T7 酶，踩了一堆坑，最近实验室一直在用一款国产 T7 RNA 聚合酶，用了快俩月，体验挺不错，来跟大家聊聊实测感受、 先说下之前头疼的几个问题： 进口酶太贵了，我们课题组经常要放大体系制备 RNA，长期用开销实在顶不住； 有些酶转录完 dsRNA 副产物特别多，后续做细胞实验、RNase 保护实验背景巨高，纯化要多过一遍柱子，产物损耗特别大； 部分产品批次差异明显，一模一样的模板和体系，有时候产量差好几倍，重复实验纯纯浪费模板、耗材； 很多牌子只卖酶，配套缓冲液不全，DTT、亚精胺都要自己配，配错一点浓度直接转录不出条带。 这款国产酶我们先入的 5000U 小包装试水，后来直接换成 25000U 大包装批量用，简单说下基础参数，都是说明书 + 实际操作对照过的： 酶浓度 50 U/μL，蛋白纯度≥95%，杂蛋白少，不会干扰转录反应；活性标定标准很清晰，37℃、pH8.0 条件下，1 单位就是 1 小时掺入 1nmol [3H] GMP，不用凭感觉盲目多加酶；-20℃避光保存能放一整年，我们反复冻融四五次，活性也没明显掉。 配套东西很省心，除了酶自带贮存缓冲液，还配好 10×T7 转录 Buffer 和单独分装的 50 mM DTT，不用自己费心配制试剂，减少人为误差。 分享一套我们实验室固定下来的 20 μL 标准转录体系，适配质粒线性化模板、PCR 产物模板，模板量 20ng–1μg 区间都稳： 无酶水补至 20 μL 10×T7 转录 Buffer 2 μL 50mM DTT 2 μL ATP/CTP/GTP/UTP 每种 1.6 μL（终浓度 2mM） RNase 抑制剂 20 U 模板 DNA 20ng–1μg T7 RNA 聚合酶 50 U 反应条件也简单，37℃孵育 1–2 小时就行，如果是长片段 RNA 可以适当延长时间，不用中途补酶。 实际使用下来几个很加分的点： 第一，对 T7 启动子特异性拉满，只会识别标准 T7 启动子序列，不会乱结合载体上其他序列，电泳跑完条带很干净，几乎看不到杂转录带； 第二，产量很可观，小体系就能拿到微克级 RNA，要是需要大量制备探针或者 RNA 原料，直接等比例放大体系，能做到毫克级产出，不用反复分批转录，省超多时间； 第三，dsRNA 副产物比之前用的酶少很多，这点做细胞实验的应该深有体会，双链 RNA 杂质多很容易激活细胞免疫，这款转录完纯化步骤简单不少，产物回收率更高，做杂交、RNA 结构相关实验背景特别干净； 第四，放大体系稳定性在线，我们好几次配 1mL 大体系批量制备，前后批次产量差异很小，重复性很好。 顺带提两个实操小提醒，都是实操总结出来的： 模板一定要在线性化处理，在目的片段下游切开，优先平端或者 5’突出末端，3’突出末端会明显降低转录效率； 缓冲液里含有亚精胺，高浓度核酸存在时可能会出现少量不溶沉淀，模板不要超过体系上限 1μg，轻微离心后完全不影响产物，不用慌张。 适用范围也挺广，不管是基础方向做 RNA 结构、RNase 保护、杂交探针合成，还是做反义 RNA、RNAi 体外转录，甚至需要小试放大大量制备 RNA 都能 hold 住，教学实验室大批量学生平行实验用它也很划算。 客观对比一下，活性、纯度完全能平替进口同类产品，大包装折算下来单单位成本低不少，经费有限、需要经常做体外转录的课题组真的可以试试，小包装 5000U 适合偶尔做少量探针的同学。 我们实验室现在已经全面替换掉之前的进口酶，近两个月几十批平行实验都没出现活性暴跌、杂带泛滥的情况。 大家平时做体外转录如果遇到产量低、杂带多、dsRNA 污染严重这类问题，欢迎评论区一起交流，这套优化好的体系细节我都可以分享给大家！ |
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