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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » actin扩不出来？
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duanming123

木虫 (正式写手)

[求助] actin扩不出来？

刚反转录出的cDNA, actin扩不出来，引物没问题，用的是Mix,模板稀释了5倍，RNA质量还行，是不是模板浓度太高了，在稀释做做？大家谁遇到种问题？
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1楼 2011-08-12 20:45:39
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sp515

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
看天(金币+5): 鼓励新人回答 2011-09-09 11:41:51
你跑一下CDNA，2ul就行，如果能看到弥散的带，那么反转录就没问题，你重做PCR就行了。
如果是CDNA的问题，你就要看看你的RNA本身有没有问题，可能是降解，也可能是有影响反转的东西，如淀粉、蛋白、残存的酒精一类的东西。如果不是，那就是反转本身的操作不当，或者试剂盒有问题
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5楼2011-09-09 08:09:50
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blessed

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+2): 鼓励交流~祝顺利！ 2011-08-14 09:18:40
duanming123(金币+1): 5 2011-08-14 17:10:37
duanming123(金币+2): 2011-08-16 19:52:31
以20ugRNA反转录起始，一般cDNA稀释5-10倍后作为模板进行PCR扩增，大概23-26个cycle就可以。如果Primer没有问题，反转录过程也没问题，那就是PCR不work了，检查PCR所使用的各个组分有没有问题。同时也要确保你的反转录过程是好的。Actin是很容易扩的。
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2楼2011-08-14 01:55:43
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qingyuansw20

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
adslye(金币+1): 反转录一般20Ul体系2ugRNA没问题，cdna可以电泳看 2011-08-14 09:20:42
adslye(金币+1): 鼓励交流，cdna跑电泳没意义 2011-08-14 09:22:36
duanming123(金币+1): 5 2011-08-14 17:10:49
1、RNA浓度问题，不知道你测定RNA浓度了吗？一个反转录体系RNA浓度要求在500ng以内。高了不行。超了引物浓度还怎么扩？一般我提出的总RNA，要稀释20倍以上。
2、CDNA没成，建议反转录后做个电泳看下，CDNA电泳一条带。
3、PCR时，内参相当容易出。按着说明书就能出。我分析是你前面的问题。
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3楼2011-08-14 08:43:44
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
duanming123(金币+1): 5 2011-08-14 17:11:51
看天(金币+2): 鼓励回答 2011-09-09 11:41:39
解决方法：反转录按你的kit说明书做，不同公司体系中RNA的量不一样。PCR设阳性对照。
最可能问题：RNA的质量。你说的质量好包括RNA条带完整，OD比为1.9-2.0 ？反转容易失败很多是酚抽提后去除不完全，导致RNA中酚超标，体现为OD比很低。
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4楼2011-08-14 09:26:14
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