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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 反转录后PCR扩不出目的条带
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by wg0541001 at 2014-11-12 20:27:03
可能有点大了，我以前扩增真菌里的cDNA片段，actin可以扩出来，但是2kb的片段就扩不出来，后来用了overlap的方法，分两个片段，每个1.1kb左右，之后overlap连接上的。...

overlap是要设计两对引物了，中间用目的序列中的酶切位点连接？？？今天一个师姐提醒我说提RNA质量很重要，P不出来可能是RNA断了，反转录的cDNA不是全长，说让先把RNA的质量提上来，她说以前P过8k的。你怎么看
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11楼2014-11-13 11:55:58
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
半岛铁盒lsf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-15 14:42:45
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12楼2014-11-13 16:47:14
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by wg0541001 at 2014-11-13 16:47:14
对啊，RNA提得好的话容易得到全长的RNA，提不好就是打断的RNA，长片段就很难扩出来。
overlap就是设计两对引物，最终得到两个片段，两个片段的尾部之间有一段相同的序列。这样通过fusion-PCR的方法可以把基因给连 ...

你说的是不是重组PCR？断裂的点是不知道的，设计引物截取目的片段的一半一半？这是不是也挺随意的，倒霉的话遇到不覆盖断裂的地方就还是P不出来？
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13楼2014-11-14 09:26:00
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
半岛铁盒lsf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-15 14:43:01
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14楼2014-11-15 12:44:11
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)
又学习到了，非常感谢，这个需要六个引物呀！感觉好多，不知道你做起来麻烦吗？
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15楼2014-11-16 22:54:21
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by running113 at 2014-11-12 15:10:36
目的片段长度，引物，PCR程序，基因表达峰度，都有可能影响！
楼主可以试试。
最近也在扩目的带，很麻烦。

请问你的弄出来了吗?我还在纠结
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16楼2014-11-16 23:18:02
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by wg0541001 at 2014-11-15 12:44:11
有点 不同的，我给你发篇文献连接就是说FusionPCR的：Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans， Nature Protocol的文章。

还有一篇是具体的操作步骤，我分享给你看看，希望对你有帮助。我P长片 ...

我现在提取得到的是总的RNA，逆转录成cDNA，在P目的条带，也就是说我没有任何可以拿来融合的条带
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17楼2014-11-16 23:20:04
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wxk19960113

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

内参能扩增出来，说明你的模板应该没问题，最有可能是你的引物设计有问题，重新设计引物试试吧。

[ 发自小木虫客户端 ]
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18楼2014-11-17 01:32:19
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百褶裙de夏天

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你逆转录的引物是什么啊，oligodT还是随机引物，如果你用的是随机引物进行逆转录的，你扩不出来很正常。
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19楼2014-11-17 09:30:40
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289363400

铁杆木虫 (知名作家)

凌乱前进方向

【答案】应助回帖

不知道这个基因的表达水平如何呢，如果很低的话，不比管家基因的高水平表达，想P出来就有难度。如果有的话，你可以参考一下关于这个基因的其它文献嘛，或者不同种属的也可以。
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20楼2014-11-17 09:38:02
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