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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)

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[求助] 反转录后PCR扩不出目的条带已有7人参与

最近刚开始自己的实验，只有一个细胞株，想要从这个细胞株里提RNA，反转录后PCR扩出需要的目的基因序列。反转录后PCR用了GAPDH的引物做对照，GAPDH能够扩出来，但是需要的目的基因条带一直扩不出来，条带都没有。模板、引物、酶量、温度梯度都试过，一直失败中，希望大家多给指点指点，求分享经验！另外，如果我需要其他的目的基因序列，能也从这个细胞株里相同方法得到吗？谢谢

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1楼2014-11-11 11:09:47

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引用回帖:

12楼: Originally posted by wg0541001 at 2014-11-13 16:47:14
对啊，RNA提得好的话容易得到全长的RNA，提不好就是打断的RNA，长片段就很难扩出来。
overlap就是设计两对引物，最终得到两个片段，两个片段的尾部之间有一段相同的序列。这样通过fusion-PCR的方法可以把基因给连 ...

你说的是不是重组PCR？断裂的点是不知道的，设计引物截取目的片段的一半一半？这是不是也挺随意的，倒霉的话遇到不覆盖断裂的地方就还是P不出来？