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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)

[求助] 反转录后PCR扩不出目的条带 已有7人参与

最近刚开始自己的实验，只有一个细胞株，想要从这个细胞株里提RNA，反转录后PCR扩出需要的目的基因序列。反转录后PCR用了GAPDH的引物做对照，GAPDH能够扩出来，但是需要的目的基因条带一直扩不出来，条带都没有。模板、引物、酶量、温度梯度都试过，一直失败中，希望大家多给指点指点，求分享经验！另外，如果我需要其他的目的基因序列，能也从这个细胞株里相同方法得到吗？谢谢
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1楼 2014-11-11 11:09:47
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shoufangche

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-11 16:36:04
GAPDH能够扩出来说明你的DNA模版是没有问题的，是引物序列不合适吧
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2楼2014-11-11 12:27:23
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koujie1986

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-11 16:36:12
扩不出来原因有很多，需要逐步排查原因。我觉得可以考虑先找其他质量可以的cDNA看看你的引物质量如何，如果引物设计有问题怎么扩都不会有带的。其次，先弄清楚该基因在你那个细胞株里面表不表达，表达时间等等。再次，RNA提取质量要有保证，这样反转录效率才高，模板质量有保证。
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3楼2014-11-11 14:49:47
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shoufangche at 2014-11-11 12:27:23
GAPDH能够扩出来说明你的DNA模版是没有问题的，是引物序列不合适吧

因为还有定量PCR的引物，就用定量PCR的引物也在普通PCR仪上试了试，也是出不来。就在想是不是提的RNA降解了，或者细胞本身表达那个蛋白还是有点少。所以打算跑胶再看看RNA，另外重新问别人要到另一个细胞株提的RNA，想一起跑胶看看再试试能不能P出来。
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4楼2014-11-11 20:18:33
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by koujie1986 at 2014-11-11 14:49:47
扩不出来原因有很多，需要逐步排查原因。我觉得可以考虑先找其他质量可以的cDNA看看你的引物质量如何，如果引物设计有问题怎么扩都不会有带的。其次，先弄清楚该基因在你那个细胞株里面表不表达，表达时间等等。再次 ...

我现在资源有限，木有可用的cDNA ，所以为了获得我的基因序列才用反转录。另外一对引物订出去了。想问一下如果只是低表达是不是就很难扩出来？表达时间是怎么来判断的？O(∩_∩)O谢谢
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5楼2014-11-11 20:24:04
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匿名

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6楼2014-11-12 14:13:54
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Ms_Ling

新虫 (小有名气)
同问
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7楼2014-11-12 15:06:18
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running113

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
半岛铁盒lsf(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-11-15 14:42:21
目的片段长度，引物，PCR程序，基因表达峰度，都有可能影响！
楼主可以试试。
最近也在扩目的带，很麻烦。

[ 发自小木虫客户端 ]
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SCI我来了！！！
8楼2014-11-12 15:10:36
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半岛铁盒lsf

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wg0541001 at 2014-11-12 14:13:54
目的片段有多大呢？

2500bp
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9楼2014-11-12 15:33:05
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匿名

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10楼2014-11-12 20:27:03
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