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dingcong1216

新虫 (小有名气)

[求助] 高保真酶能P出来产物加A后载体连接 菌液PCR鉴定不出来 已有2人参与

最近做克隆,已经克出全长,但要用高保真酶验证一下是否有错配,用的takara的Pyrobest ,胶回收后加A反应(72℃ 20min),直接进行载体连接,转化后菌液鉴定没有条带,Pyrobest这个酶剩余的量不多,不够一次PCR的,菌液鉴定就用的是普通的rTaq,没有条带与这个有关系吗?是鉴定的话也要用高保真酶吗?
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-08 15:17:21
有可能,普通的taq酶扩增效率没有高保真酶高,特别是扩长片段的时候。建议如果只是鉴定的话,可以只PCR目的基因的一部分,最好1k左右或以下。再者可以酶切鉴定。
3楼2014-11-08 04:50:27
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小松果2012

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-11-08 15:17:11
貌似没有关系,前几天刚做过类似的实验。P的时候用PFU酶,菌液检测的时候用的普通的酶。
2楼2014-11-07 23:29:06
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