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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 高保真酶能P出来产物加A后载体连接 菌液PCR鉴定不出来
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dingcong1216

新虫 (小有名气)

[求助] 高保真酶能P出来产物加A后载体连接 菌液PCR鉴定不出来 已有2人参与

最近做克隆，已经克出全长，但要用高保真酶验证一下是否有错配，用的takara的Pyrobest ，胶回收后加A反应（72℃ 20min），直接进行载体连接，转化后菌液鉴定没有条带，Pyrobest这个酶剩余的量不多，不够一次PCR的，菌液鉴定就用的是普通的rTaq，没有条带与这个有关系吗？是鉴定的话也要用高保真酶吗？
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1楼 2014-11-07 23:19:22
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小松果2012

银虫 (正式写手)

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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-08 15:17:11
貌似没有关系，前几天刚做过类似的实验。P的时候用PFU酶，菌液检测的时候用的普通的酶。
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2楼2014-11-07 23:29:06
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-11-08 15:17:21
有可能，普通的taq酶扩增效率没有高保真酶高，特别是扩长片段的时候。建议如果只是鉴定的话，可以只PCR目的基因的一部分，最好1k左右或以下。再者可以酶切鉴定。
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3楼2014-11-08 04:50:27
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