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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » T-RFLP中回收及酶切相关问题
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张永婧1991

新虫 (初入文坛)

[求助] T-RFLP中回收及酶切相关问题 已有4人参与

我做的是肠道微生物多态性，用T-RFLP技术，已经提取出基因组总DNA，PCR体系为25ul,用通用引物扩增出目的片段，1500bp左右，条带较亮且单一，无引物二聚体等其他杂物，然后用2%的琼脂糖凝胶跑电泳做切胶回收，用的是Axygen的凝胶回收试剂盒，每次每孔回收上样量为10ul，然后将3个孔的条带切胶回收，回收后的DNA浓度却只有10ng/ul左右，用过天根的试剂盒也是基本上差不多。然后看到论坛上有人说单一条带可以不同切胶回收直接就酶切就可以，于是按照酶切体系进行酶切，PCR产物用5ul,酶用1ul。结果还是没有条带，正常情况如果不酶切的话，那条目的条带应该是存在的吧，但是酶切之后没有，说明是切开了？可是什么小条带都看不见。。还有就是如果直接PCR产物酶切的话，这个产物还要做什么预处理吗？求求各位大神，这些都快做了一个月了，还是没有结果。。。快哭了呀！以前没接触过分子，望大神指导！图1是回收后做酶切的条带，就是这种情况。

T-RFLP中回收及酶切相关问题
图1.jpg
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1楼 2014-10-25 16:28:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

j2

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不用loading buffer能跑出东西来？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
9楼2014-10-28 21:28:22
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peterrjp

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 张永婧1991 at 2014-10-26 18:30:34
我做的引物有荧光标记，纯化会对产物的荧光有影响吗？我看试剂盒的说明是可以去除荧光的？我今天又切胶了，结果还是不好！...

生工、天根的PCR切胶回收或过柱纯化试剂盒都没关系的。当年我专门负责T-RFLP分析仪
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7楼2014-10-26 21:17:20
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普通回帖

peterrjp

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张永婧1991(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-26 20:46:51
实在不行可以试试PCR过柱纯化试剂盒，不过用过柱纯化会在0~50bp之间有个很高的杂峰，使用数据时就别用小于50bp的峰了。
PCR产物需要纯化后才能做酶切。
我上学时还是经常做这个的。
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2楼2014-10-25 20:07:26
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张永婧1991

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by peterrjp at 2014-10-25 20:07:26
实在不行可以试试PCR过柱纯化试剂盒，不过用过柱纯化会在0~50bp之间有个很高的杂峰，使用数据时就别用小于50bp的峰了。
PCR产物需要纯化后才能做酶切。
我上学时还是经常做这个的。

纯化应该比切胶回收好很多吧？现在情况就是切胶收不回来，不切直接酶切还是没条带。。
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3楼2014-10-26 10:38:43
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peterrjp

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 张永婧1991 at 2014-10-26 10:38:43
纯化应该比切胶回收好很多吧？现在情况就是切胶收不回来，不切直接酶切还是没条带。。...

切胶回收效率低，过柱纯化也还凑合能用，总比你不纯化来得好。不纯化，杂质会影响酶切
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4楼2014-10-26 10:48:46
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张永婧1991

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by peterrjp at 2014-10-26 10:48:46
切胶回收效率低，过柱纯化也还凑合能用，总比你不纯化来得好。不纯化，杂质会影响酶切...

我做的引物有荧光标记，纯化会对产物的荧光有影响吗？我看试剂盒的说明是可以去除荧光的？我今天又切胶了，结果还是不好！
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5楼2014-10-26 18:30:34
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张永婧1991

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by peterrjp at 2014-10-26 10:48:46
切胶回收效率低，过柱纯化也还凑合能用，总比你不纯化来得好。不纯化，杂质会影响酶切...

这个图是我今天做的几个对比，第一个是250bp的marker；第二个是PCR产物的电泳条带，正常的目的条带应该是在第三个位置，因为怕酶切的小片段跑没了就把时间缩短了；第三个是直接酶切PCR产物的，没做任何纯化步骤；第四个是把切胶回收后的DNA酶切的；第五个是50bp的marker。酶切的两个均没有用loading buffer，是37度酶切后65度失活的，因为我觉得loading加入后电泳什么都看不到。还有就是，第二个是正常PCR产物条带，而第三个酶切之后这个条带没有了，是不是说明已经切出来了，但是没看到亮带，第四个基本上看不到什么。
T-RFLP中回收及酶切相关问题-1
zyj1036-102601.jpg
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6楼2014-10-26 18:54:31
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xavier_yu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
张永婧1991(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-29 08:56:18
我也做RFLP，切胶回收这块，你只加样10ul是不是有点少，我一般PCR做20ul体系，跑胶都是全加的。
你的PCR产物是最亮的那条带吗？你说是第三个，不知道指哪个。
你的PCR结果好，没有其他条带影响的话，就不用切胶回收了，直接酶切没有问题的。
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8楼2014-10-28 10:04:39
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张永婧1991

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xavier_yu at 2014-10-28 10:04:39
我也做RFLP，切胶回收这块，你只加样10ul是不是有点少，我一般PCR做20ul体系，跑胶都是全加的。
你的PCR产物是最亮的那条带吗？你说是第三个，不知道指哪个。
你的PCR结果好，没有其他条带影响的话，就不用切胶回 ...

恩，我已经做好了，直接把PCR产物过柱纯化，然后再酶切的~
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10楼2014-11-06 10:35:07
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