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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 最近在做原核表达纯化，但是蛋白一直都没有诱导出来。好捉急啊！
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露的想念

新虫 (小有名气)

[求助] 最近在做原核表达纯化，但是蛋白一直都没有诱导出来。好捉急啊！ 已有2人参与

最近在构建表达人的6KD左右的蛋白，从生物公司合成的基因，以及是公司构建的表达载体（pET-30a），用的是His标签，拿回来换了许多诱导条件，在相应的位置上也没有条带，有人建议说把目的基因切下来重新连到pET-30a上，大家觉得有这种必要吗？有没有人遇到这种情况啊？急急急
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1楼 2014-10-23 16:47:42
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.表达载体是否已经过测序验证，如果没有，一定要做。
2.如果测序没有问题，那可能就是诱导条件的问题，一通常做法是改变诱导物IPTG浓度、降低表达温度。
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2楼2014-10-23 18:22:35
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-10-23 18:22:35
1.表达载体是否已经过测序验证，如果没有，一定要做。
2.如果测序没有问题，那可能就是诱导条件的问题，一通常做法是改变诱导物IPTG浓度、降低表达温度。

没有测序了，从公司拿回来就看了一下公司给的序列，没问题，试了好多诱导条件，还是不行啊
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3楼2014-10-23 18:44:17
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scqing

捐助贵宾 (小有名气)
是不是表达出来，但没挂上镍柱？
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4楼2014-10-24 14:05:04
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
6k不好表达，换pet32试试

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5楼2014-10-24 21:06:32
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by scqing at 2014-10-24 14:05:04
是不是表达出来，但没挂上镍柱？

我还没有纯化了，只是小摇都没有诱导出来了
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6楼2014-10-25 23:30:00
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露的想念

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by myheat at 2014-10-24 21:06:32
6k不好表达，换pet32试试

这个32跟30有很大区别吗？我在这方面是个菜鸟
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7楼2014-10-25 23:31:27
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myheat

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 露的想念 at 2014-10-25 23:31:27
这个32跟30有很大区别吗？我在这方面是个菜鸟...

32有trx融合，短肽单独表达基本不会成功。多看文献。

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8楼2014-10-26 20:31:19
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jackie.z

新虫 (初入文坛)
如果换了多次诱导条件的话且测序无误，建议WB验证下是否表达
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9楼2014-10-27 23:54:15
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dt_lilin

铜虫 (初入文坛)
你表达的基因和载体的序列有没有冲突？ 人的基因在原核系统中表达，不成功也很常见，建议看看基因表达优化（包括标签/载体/密码子优化）
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10楼2014-11-03 16:47:14
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