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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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露的想念

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

[求助] 最近在做原核表达纯化,但是蛋白一直都没有诱导出来。好捉急啊! 已有2人参与

最近在构建表达人的6KD左右的蛋白,从生物公司合成的基因,以及是公司构建的表达载体(pET-30a),用的是His标签,拿回来换了许多诱导条件,在相应的位置上也没有条带,有人建议说把目的基因切下来重新连到pET-30a上,大家觉得有这种必要吗?有没有人遇到这种情况啊?急急急
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stone2239

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1.表达载体是否已经过测序验证,如果没有,一定要做。
2.如果测序没有问题,那可能就是诱导条件的问题,一通常做法是改变诱导物IPTG浓度、降低表达温度。
2楼2014-10-23 18:22:35
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露的想念

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-10-23 18:22:35
1.表达载体是否已经过测序验证,如果没有,一定要做。
2.如果测序没有问题,那可能就是诱导条件的问题,一通常做法是改变诱导物IPTG浓度、降低表达温度。

没有测序了,从公司拿回来就看了一下公司给的序列,没问题,试了好多诱导条件,还是不行啊
3楼2014-10-23 18:44:17
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scqing

禁虫


是不是表达出来,但没挂上镍柱?
4楼2014-10-24 14:05:04
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myheat

版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
6k不好表达,换pet32试试

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2014-10-24 21:06:32
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露的想念

专家顾问

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
4楼: Originally posted by scqing at 2014-10-24 14:05:04
是不是表达出来,但没挂上镍柱?

我还没有纯化了,只是小摇都没有诱导出来了
6楼2014-10-25 23:30:00
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露的想念

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

引用回帖:
5楼: Originally posted by myheat at 2014-10-24 21:06:32
6k不好表达,换pet32试试

这个32跟30有很大区别吗?我在这方面是个菜鸟
7楼2014-10-25 23:31:27
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myheat

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 露的想念 at 2014-10-25 23:31:27
这个32跟30有很大区别吗?我在这方面是个菜鸟...

32有trx融合,短肽单独表达基本不会成功。多看文献。

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-10-26 20:31:19
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jackie.z

实习版主

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!

如果换了多次诱导条件的话且测序无误,建议WB验证下是否表达
9楼2014-10-27 23:54:15
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dt_lilin

兑换贵宾

优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!优秀!!有木有!!!


你表达的基因和载体的序列有没有冲突? 人的基因在原核系统中表达,不成功也很常见,建议看看基因表达优化(包括标签/载体/密码子优化)
10楼2014-11-03 16:47:14
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