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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 纯化后蛋白中DNA污染检测
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honeywanghe

铁虫 (初入文坛)

[求助] 纯化后蛋白中DNA污染检测 已有3人参与

求教下有什么方法可以检测纯化后的蛋白中是否含有DNA污染、污染程度如何呀？
求大神指点！谢谢啦！
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1楼 2014-10-15 17:15:55
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
honeywanghe: 金币+4, ★有帮助 2014-10-17 12:55:54
引用回帖:
4楼: Originally posted by honeywanghe at 2014-10-16 13:54:56
谢谢  我做的是蛋白酶  需要检验纯化后的蛋白酶是否有DNA污染  因为纯化过程中已经尽量减少DNA的存在了  现在的目的就是要在不影响酶活的前提下验证是否成功  是否DNA污染足够小以致可以忽略其对酶活性的影响。 不 ...

我这里假设你用大肠杆菌作为宿主菌表达你的目的蛋白，那么纯化中最大的污染源就是大肠杆菌的基因组DNA和质粒DNA
所以选一个大肠杆菌的保守基因，做一个荧光定量，可以定量得出你的蛋白核酸含量。
然后这个浓度足够低的情况下，应该可以排除核酸对你的蛋白活性的影响。
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行至水穷处，坐看云起时
6楼2014-10-16 22:58:22
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普通回帖

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
个人意见，选一个宿主菌或细胞的保守基因，然后上荧光定量，如果低于某个数值，就可以认为没有了吧？
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2014-10-15 17:24:11
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毛毛虫123321

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
honeywanghe(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-16 14:57:39
紫外分光光度计测A260 和A280  一般 A280/A260在1.5-2.0之间 蛋白纯度较高 基本无核酸
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3楼2014-10-16 10:55:42
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honeywanghe

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2014-10-15 17:24:11
个人意见，选一个宿主菌或细胞的保守基因，然后上荧光定量，如果低于某个数值，就可以认为没有了吧？

谢谢  我做的是蛋白酶  需要检验纯化后的蛋白酶是否有DNA污染  因为纯化过程中已经尽量减少DNA的存在了  现在的目的就是要在不影响酶活的前提下验证是否成功  是否DNA污染足够小以致可以忽略其对酶活性的影响。 不知可有什么好的建议  期待您的解答！
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4楼2014-10-16 13:54:56
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honeywanghe

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 毛毛虫123321 at 2014-10-16 10:55:42
紫外分光光度计测A260 和A280  一般 A280/A260在1.5-2.0之间 蛋白纯度较高 基本无核酸

谢谢   我目前的蛋白纯度已经很高了  由于是蛋白酶因此要求更精确 污染更小  所以要检测微量DNA的存在
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5楼2014-10-16 13:56:42
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-17 15:52:56
纯化的时候加过量的DNA酶和氯化镁，充分降解DNA，经过几步纯化后就不会有DNA了。
痕量、超痕量检测很难，也没有必要。前期工作做充分了，后来就不用担心了。
希望对你有帮助！
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7楼2014-10-17 08:19:15
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honeywanghe

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by pennchem at 2014-10-16 22:58:22
我这里假设你用大肠杆菌作为宿主菌表达你的目的蛋白，那么纯化中最大的污染源就是大肠杆菌的基因组DNA和质粒DNA
所以选一个大肠杆菌的保守基因，做一个荧光定量，可以定量得出你的蛋白核酸含量。
然后这个浓度足 ...

谢谢   受用了   不过这个浓度足够低有木有相关文献显示低到什么程度可以排除核酸对蛋白活性的影响呀？
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8楼2014-10-17 12:55:47
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honeywanghe

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lihe131 at 2014-10-17 08:19:15
纯化的时候加过量的DNA酶和氯化镁，充分降解DNA，经过几步纯化后就不会有DNA了。
痕量、超痕量检测很难，也没有必要。前期工作做充分了，后来就不用担心了。
希望对你有帮助！

谢谢！  不过我们现在的主要目的就是要检测这个酶的污染情况 需要得出定量的结果
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9楼2014-10-17 12:57:47
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pennchem

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by honeywanghe at 2014-10-17 12:55:47
谢谢   受用了   不过这个浓度足够低有木有相关文献显示低到什么程度可以排除核酸对蛋白活性的影响呀？...

这个，我的理解是，如果有标准，就按标准来，如果没有，你自己就做一个标准出来。
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行至水穷处，坐看云起时
10楼2014-10-18 14:17:27
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