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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 各位大神，帮忙分析一下pcr只跑出引物二聚体，没有目的条带！
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aounao

新虫 (初入文坛)

[求助] 各位大神，帮忙分析一下pcr只跑出引物二聚体，没有目的条带！ 已有2人参与

做的是菌液pcr，之前一直都可以跑出目的条带，有时会有引物二聚体，但是目的条带也都是比较亮的，但是最近只有引物二聚体了，做了很多次还是这样，找不到原因。
pcr是25微升的体系
LA   0.2
10*LA pcr buffer   2.5
dNTP   4
引物用的是通用引物   各为1
无菌水 15.3
菌液   1

pcr体系是
95度 10min
94度 30s
35度 30s
72度 1min
72度 10min
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1楼 2014-10-13 21:14:18
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反应链

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
aounao(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:52:48
1. 菌落PCR比较好，配好pcr体系后，灭菌牙签挑取单菌落加到体系中，运行PCR。

2. 用菌液也行，不过要煮沸裂解，取上清做模板。200微升菌液，离心集菌，50微升灭菌水悬浮，沸水浴5min，离心取1微升上清做模版，配体系，运行PCR。

3. 退火温度太低了，你通用引物Tm值多少？一般Tm值55，因此退火温度可用56.
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2楼2014-10-13 23:53:02
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aounao

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 反应链 at 2014-10-13 23:53:02
1. 菌落PCR比较好，配好pcr体系后，灭菌牙签挑取单菌落加到体系中，运行PCR。

2. 用菌液也行，不过要煮沸裂解，取上清做模板。200微升菌液，离心集菌，50微升灭菌水悬浮，沸水浴5min，离心取1微升上清做模版，配 ...

tm值一个引物是41一个是36
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3楼2014-10-14 08:37:56
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物的Tm太低了，可以适当增加以下引物长度，提高一下Tm值。退火温度太低的或容易形成引物二聚体，Tm值最好在55-60℃之间（我自己的经验）。
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他日扬翼九万里，历大千世界，定我红尘心！
4楼2014-10-14 20:48:02
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