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aounao

新虫 (初入文坛)

[求助] 各位大神,帮忙分析一下pcr只跑出引物二聚体,没有目的条带! 已有2人参与

做的是菌液pcr,之前一直都可以跑出目的条带,有时会有引物二聚体,但是目的条带也都是比较亮的,但是最近只有引物二聚体了,做了很多次还是这样,找不到原因。
pcr是25微升的体系
LA   0.2
10*LA pcr buffer   2.5
dNTP   4
引物用的是通用引物   各为1
无菌水 15.3
菌液   1

pcr体系是
95度 10min
94度 30s
35度 30s
72度 1min
72度 10min
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wangranjun

荣誉版主 (知名作家)

广庭之惘然

优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引物的Tm太低了,可以适当增加以下引物长度,提高一下Tm值。退火温度太低的或容易形成引物二聚体,Tm值最好在55-60℃之间(我自己的经验)。
他日扬翼九万里,历大千世界,定我红尘心!
4楼2014-10-14 20:48:02
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反应链

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
aounao(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-10-14 10:52:48
1. 菌落PCR比较好,配好pcr体系后,灭菌牙签挑取单菌落加到体系中,运行PCR。

2. 用菌液也行,不过要煮沸裂解,取上清做模板。200微升菌液,离心集菌,50微升灭菌水悬浮,沸水浴5min,离心取1微升上清做模版,配体系,运行PCR。

3. 退火温度太低了,你通用引物Tm值多少?一般Tm值55,因此退火温度可用56.
2楼2014-10-13 23:53:02
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aounao

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 反应链 at 2014-10-13 23:53:02
1. 菌落PCR比较好,配好pcr体系后,灭菌牙签挑取单菌落加到体系中,运行PCR。

2. 用菌液也行,不过要煮沸裂解,取上清做模板。200微升菌液,离心集菌,50微升灭菌水悬浮,沸水浴5min,离心取1微升上清做模版,配 ...

tm值一个引物是41一个是36
3楼2014-10-14 08:37:56
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