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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR产物测序重叠峰问题
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hihe99

银虫 (小有名气)

[求助] PCR产物测序重叠峰问题 已有3人参与

我用相同的DNA做两次PCR，产物胶回收送测序，两个样品的测序结果都是后面形成双峰（图4），还是相同的位置，而且我看前面的相同位置也有重叠峰（图1-3），请问这是什么原因啊？该怎么解决，谢谢！PSCR用的酶是primerstar

PCR产物测序重叠峰问题
1.jpg


PCR产物测序重叠峰问题-1
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PCR产物测序重叠峰问题-2
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PCR产物测序重叠峰问题-3
4.jpg
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1楼 2014-09-15 12:43:46
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hihe99

银虫 (小有名气)
怎么没人啊
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2楼2014-09-18 15:02:54
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
hihe99: 金币+1 2014-09-19 18:33:16
很正常哈！一般测序的前面几十个碱基和后面几十个碱基不怎么准确，波峰不稳定，测序一个反应最多就只能准确的侧800bp左右！
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3楼2014-09-18 15:31:00
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hihe99

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-09-18 16:31:00
很正常哈！一般测序的前面几十个碱基和后面几十个碱基不怎么准确，波峰不稳定，测序一个反应最多就只能准确的侧800bp左右！

你说的是正常情况，不过我的是300多。。。
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4楼2014-09-19 18:32:58
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+4, 鼓励回帖交流！ 2014-09-19 23:42:43
hihe99: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-26 10:50:50
你这种情况推测可能是这个原因造成的：DNA的多态性，大家都知道，不同的品种基因组DNA会有差异的，类似SSR、SNP这样的分子标记就是因为不同品种间DNA存在差异，所以我推测你提取DNA的材料可能是杂交材料或者至少不是纯种，你拉取的这一段刚好存在序列差异，PCR拉出的产物自然就有两种类型了，测序出现重叠峰也就正常了，而且一定是出现在同一个地方。
建议：不要送PCR产物测序，将其克隆到载体上（如pMD-18T）再行测序，由于挑的是单菌落，不会出现重叠峰的，而且都测几个样，可以讲出现差异的序列各找出来，根据同源比对还可以找出样品可能的亲本来源。

个人意见，仅供参考
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没有做不到，只有想不到！
5楼2014-09-19 22:05:04
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
hihe99: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-09-26 10:50:57
由于你是拿PCR产物直接测序，所以
图1-3的套峰是由于SNP造成的
图4后面的双峰是由于In-Del造成的
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2014-09-19 23:44:50
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