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新虫 (初入文坛)

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[求助] pet28a 空质粒双酶切图像问题已有1人参与

本人新手，最近做蛋白表达，前期做克隆，想先把表达载体空质粒pet28a双酶切空质粒大小5369bp，但是图像把我搞迷糊了，希望各位高手指点迷津
第一张图是第一个孔是2000Marker 当时加错了
第二个孔 BamH I和EcoR I 双酶切 pet28a
第三个是先BamH I单酶切再EcoR I单酶切
第四个是EcoR I SaL I 双酶切
第五个是15000Marker 提pet28a质粒浓度比较低，用的洗脱水80ul 体系10ul buffer2ul 质粒6ul 酶各1ul 正常情况双酶切应该有两个片段，我的为什么只有一个小片段呢，
还有看pet28a图谱 BamH I和EcoR I两个酶挨着有人说不能切？我的图是切下来了吗？不然怎么会有小片段

第二张图第一个孔15000Marker
2-7都是双酶切就是酶用的不一样，可惜忘记加空质粒对照了但是6.7buffer加错了BamH I和SaL I应该加Tbuffer 我加了H buffer 好像没切下来看图像比前四个高一点应该可以当做空质粒对照吧，是不是可以证明前四个切下来了就是切下来的片段太小了浓度太低看不到？
这张图是只有载体没有目的片段我真不知道切没切下来体系20ul 载体8ul 酶各0.5ul buffer2ul 加 ddH2O到20ul 提空质粒时加洗脱水80ul同样浓度很低
综合分析这两个图体系不同一个有小片段，一个只有质粒这是什么原因怎么改进？另外BamH I和EcoR I到底能不能切pet28a啊？

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1楼 2014-09-10 22:04:39

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引用回帖:

2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-09-10 22:45:58
1.你选的BamH I和EcoR I在空载上相隔8个碱基，EcoR I和 SaL I在空载上相隔20个碱基，后一对组合更容易完全酶切，前一对组合是有可能只被切一次。
2.两对组合切下来的小片段都不能通过琼脂糖电泳显示出来，不明白你 ...

哦我说的小片段就是从空载体双酶切切下来的片段应该在200.300左右吧你说我第一个图显示的条带是不是这种小片段啊？出现这种现象的原因是什么啊