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95846713

新虫 (初入文坛)

[求助] pet28a 空质粒双酶切图像问题 已有1人参与

本人新手，最近做蛋白表达，前期做克隆，想先把表达载体空质粒pet28a双酶切 空质粒大小5369bp，但是图像把我搞迷糊了，希望各位高手指点迷津
第一张图是第一个孔是2000Marker 当时加错了
第二个孔 BamH I和EcoR I 双酶切 pet28a
第三个是先BamH I单酶切再EcoR I单酶切
第四个是EcoR I SaL I 双酶切
第五个是15000Marker 提pet28a质粒浓度比较低，用的洗脱水80ul 体系10ul buffer2ul 质粒6ul 酶各1ul 正常情况双酶切应该有两个片段，我的为什么只有一个 小片段呢 ，
还有看pet28a图谱 BamH I和EcoR I两个酶挨着 有人说不能切？我的图是切下来了吗？不然怎么会有小片段


第二张图第一个孔15000Marker
2-7都是双酶切就是酶用的不一样，可惜忘记加空质粒对照了 但是6.7buffer加错了BamH I和SaL I应该加Tbuffer 我加了H buffer 好像没切下来 看图像比前四个高一点 应该可以当做空质粒对照吧，是不是可以证明前四个切下来了 就是切下来的片段太小了浓度太低 看不到？
这张图是只有载体 没有目的片段 我真不知道切没切下来 体系20ul 载体8ul 酶各0.5ul buffer2ul 加 ddH2O到20ul 提空质粒时加洗脱水80ul同样浓度很低
综合分析这两个图 体系不同 一个有小片段，一个只有质粒 这是什么原因 怎么改进？另外BamH I和EcoR I到底能不能切pet28a啊？

pet28a 空质粒双酶切图像问题
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pet28a 空质粒双酶切图像问题-1
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1楼 2014-09-10 22:04:39
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95846713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by stone2239 at 2014-09-11 09:44:33
别人论文是300，那可能是别人这个载体中基因插入了外源基因。如果确定你的载体没问题，那肯定不会是300。...

哦  我也核对了 别人的确实是插入了外源基因  我是新手 看的比较马虎 那像我BamH I和Hind iii这样双酶切空质粒pet28a 一般也就几十bp吧，一般电泳是看不到了，我是不是只有双酶切空质粒后再比对没有酶切的空质粒 才能看出来啊？
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10楼2014-09-11 11:16:30
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
95846713(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-09-11 09:24:03
1.你选的BamH I和EcoR I在空载上相隔8个碱基，EcoR I和 SaL I在空载上相隔20个碱基，后一对组合更容易完全酶切，前一对组合是有可能只被切一次。
2.两对组合切下来的小片段都不能通过琼脂糖电泳显示出来，不明白你说的小片段指的哪条带？我没有看到。
3.因为单酶切与双酶切产生的大片段大小非常接近，是否完全双酶切无法通过电泳判断。
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2楼2014-09-10 22:45:58
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95846713

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2014-09-10 22:45:58
1.你选的BamH I和EcoR I在空载上相隔8个碱基，EcoR I和 SaL I在空载上相隔20个碱基，后一对组合更容易完全酶切，前一对组合是有可能只被切一次。
2.两对组合切下来的小片段都不能通过琼脂糖电泳显示出来，不明白你 ...

哦  我说的小片段就是从空载体双酶切切下来的片段 应该在200.300左右吧    你说我第一个图显示的条带是不是这种小片段啊？出现这种现象的原因是什么啊
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3楼2014-09-10 22:54:59
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 95846713 at 2014-09-10 22:54:59
哦  我说的小片段就是从空载体双酶切切下来的片段 应该在200.300左右吧    你说我第一个图显示的条带是不是这种小片段啊？出现这种现象的原因是什么啊...

200-300?你怎么算的？好好看下pET28的载体图
第一个图里是大片段，大小都已经超过2000了，和你15000marker对一下就知道具体多大。
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4楼2014-09-10 23:32:10
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