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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 直接用DNA为模板进行荧光定量PCR可行吗？
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纠结的面包

新虫 (初入文坛)

[求助] 直接用DNA为模板进行荧光定量PCR可行吗？ 已有3人参与

作为刚接触分子生物的小白，老板也不太了解荧光定量PCR,只是给出任务说要用类似的方法检测土壤中产CA功能菌及CA表达的变化情况。因为土壤中提取RNA难度太高，所以放弃了检测CA表达量的变化，在看了相关文献后，看到有人说可以直接提取宏基因组，然后以特定功能基因为模板进行PCR之后制作质粒，通过和标准品CT值的对比可以得出功能菌的丰度变化情况，请问可行吗？
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1楼 2014-09-08 16:22:20
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biot

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-08 20:05:28
纠结的面包: 金币+1 2014-09-13 01:34:43
完全可行，你要提取尽量高质量的DNA，设计好引物，构建好质粒标准品，最后可计算出拷贝数

[ 发自小木虫客户端 ]
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扬帆起航！
2楼2014-09-08 19:58:38
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纠结的面包

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biot at 2014-09-08 19:58:38
完全可行，你要提取尽量高质量的DNA，设计好引物，构建好质粒标准品，最后可计算出拷贝数

谢谢！如果可能的话有没有相关的文献推荐？麻烦了
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3楼2014-09-09 09:14:36
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2014-09-09 09:54:04
纠结的面包: 金币+1 2014-09-13 01:34:50
用DNA的话, 测该菌的量是可以的. 如果你的CA(不知道是什么)是蛋白或者功能蛋白产物,用DNA是无法得到表达量变化的.
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4楼2014-09-09 09:29:27
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纠结的面包

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xipha at 2014-09-09 09:29:27
用DNA的话, 测该菌的量是可以的. 如果你的CA(不知道是什么)是蛋白或者功能蛋白产物,用DNA是无法得到表达量变化的.

CA是碳酸酐酶，老板的意思是既然酶的表达量测定不出来，就想验证下产CA的典型菌的丰度和溶蚀量是不是成正比，目前是在研究一株从当地土壤中筛选出来的细菌，想着设计引物对CA基因进行PCR后制作质粒，通过和标准品曲线的比对得出这种细菌含量随季节的变化，应该是可行的吧？
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5楼2014-09-09 16:15:02
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a314919473

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
纠结的面包(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-09-10 08:44:41
这个很简单：绝对定量
1. 测量300mg土壤，提取DNA。
2. 设计CA（猜测是产甲烷杆菌），的引物，PCR
3. 克隆并测序：将PCR产物电泳，纯化，TA克隆，得到质粒，进行拷贝数换算。
4. qPCR检测，得到具体拷贝数（换算成XX拷贝数/mg土壤）
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有你真好
6楼2014-09-09 16:19:06
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xipha

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 纠结的面包 at 2014-09-09 16:15:02
CA是碳酸酐酶，老板的意思是既然酶的表达量测定不出来，就想验证下产CA的典型菌的丰度和溶蚀量是不是成正比，目前是在研究一株从当地土壤中筛选出来的细菌，想着设计引物对CA基因进行PCR后制作质粒，通过和标准品曲 ...

这个事没问题的. 酶的表达量没办法测酶活或者做westernblot么?
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7楼2014-09-10 08:41:54
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