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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 扩增不出产物
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tuhua

新虫 (小有名气)

[求助] 扩增不出产物 已有5人参与

本人刚合成的引物正在做梯度PCR，目的条带为1650bp,公司合成的单子显示的上游引物为58.3，下游为58.9。用普通的aq酶没有扩增出来， 引物二聚体也没有，所用的枪头，管子都是刚灭菌的，cDNA没有问题，在超净工作台上操作。体系是20ul ，具体如下，
Taq酶  0.3ul，
10*Buffer 2 ul，
dNTP  1ul，
cDNA 0.5ul，
Mgcl2  1.2ul (25mM)
上游引物0.5
下游引物0.5
ddH2O  14ul


95      5min
95     30s
54/64  50s
72     100s
28个循环
72    10min

请各位帮忙分析下，是什么原因呢
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1楼 2014-08-22 15:58:31
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bwangel

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-23 20:29:19
tuhua: 金币+1, ★★★很有帮助 2014-08-23 21:40:30
tuhua: 金币+1 2014-09-07 18:49:05
什么都没有，先要排除药品和仪器的问题，然后你用58度跑次试试，别梯度了，可能是梯度的问题
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2014-08-23 07:41:38
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
tuhua: 金币+2, ★★★很有帮助 2014-09-07 18:48:34
1、这个最佳退火温度就是58度左右，不需要梯度。

2、引物和器材应该没有问题

3、模板用的cDNA，所以问题也可能出在模板上，建议用内参引物排除模板可能出现的问题

4、酶也可能出现问题，用的时间长了效率也会降低的

5、再就是电泳，不知道Marker有没有出来

6、你的循环次数是不是有点少，建议加到30——35个循环


以上个人见解，仅供参考
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没有做不到，只有想不到！
3楼2014-08-25 22:27:06
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
tuhua: 金币+1 2014-09-07 18:48:41
退火试下60度   应该可以
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4楼2014-08-26 10:56:05
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杨仔

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
tuhua(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-27 19:17:17
tuhua: 金币+1 2014-09-07 18:48:47
你确定这个转录本在这种CDNA的表达量高吗，可以查一下BIOGPS？出不来最好p个35-40cyc
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5楼2014-08-27 14:18:36
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shizishanshang

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
tuhua: 金币+1 2014-09-07 18:48:56
循环少，不用超净台
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6楼2014-08-27 15:25:41
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tuhua

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王平阳 at 2014-08-25 22:27:06
1、这个最佳退火温度就是58度左右，不需要梯度。

2、引物和器材应该没有问题

3、模板用的cDNA，所以问题也可能出在模板上，建议用内参引物排除模板可能出现的问题

4、酶也可能出现问题，用的时间长了效率也 ...

我把酶在变性之后加入，用33个循环就扩出来了
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7楼2014-09-07 18:58:34
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