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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 细菌质粒提取及ＰＣＲ
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hnsea

铜虫 (小有名气)

[求助] 细菌质粒提取及ＰＣＲ 已有4人参与

如题，细菌用小提试剂盒提取质粒，浓度在几十至100ug/ml。
进行多个相关耐药基因（200-500bp）扩增并电泳检测，没有一个条带。marker(1000bp)也不亮，没完全分开。
是操作设计不好吗啊？
请分析下原因。
pcr条件如下:94度预热5-8min，94变性40S，Tm减5度退火40S,72度再延伸40s，重复30个循环，72度再延伸5min，4度保持。

琼脂糖电泳条件:1%的胶，120ev，120mA.
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当我哭泣我没有好看的鞋子时， 却发现有人连脚都没有。
1楼 2014-07-27 22:04:06
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songzuowei

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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hnsea(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-28 11:13:51
1.marker(1000bp)也不亮，说明你做的琼脂糖凝胶质量不好，要么是旧胶，要么是核酸染料太少
2.进行多个相关耐药基因一个也扩增不出来，原因本身有2：一是模板质量太差二是PCR体系存在问题，是否漏加了组分如dNTP等
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2楼2014-07-28 09:37:50
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hnsea

铜虫 (小有名气)
非常感谢您的回复，请问我的模板浓度还行吗？成分是不会漏加的，做了好几轮呢。PCR程序设计没问题吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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当我哭泣我没有好看的鞋子时， 却发现有人连脚都没有。
3楼2014-07-28 09:51:01
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鬼羽帝魂

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hnsea(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-07-28 11:14:02
模板浓度大约20ng/ul就可以了。
琼脂糖电泳条件:1%的胶，90ev，25min试试看，如果没跑好，再加点时间。
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4楼2014-07-28 10:51:00
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hnsea

铜虫 (小有名气)
今天按照楼下的方法，30min的时候有两条带，但位置是一样的，实际上用的是不一样的基因引物，也不够清楚，marker没扩开；继续10min左右marker扩的比较好了。但两条带不见了.
不知是什么原因？
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当我哭泣我没有好看的鞋子时， 却发现有人连脚都没有。
5楼2014-07-29 00:10:56
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愚者517

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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hnsea: 金币+2, ★有帮助 2014-07-29 22:50:54
I give you a experiment plan:  first:   Agarose electrophoresis conditions: 0.8% glue, 120 V,  100mA.
                                          second:  PCR conditions : preheated 94 degrees 9 min, 94 modified 30S,  annealing of 30S, extends 30s, repeated for 28 cycles, 72 degrees and then extends 5min, 4 degrees.
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6楼2014-07-29 14:24:20
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499649610

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-29 16:41:08
gyesang: 回帖置顶 2014-07-29 16:41:11
一半电泳时电压120V电流不会有那么高吧，当电流升高太多，这个时候电泳缓冲液肯定是要换了的。如果片段较小，可以采用较大浓度的胶（1.5%-2%），电压80-100v可能能跑的更清楚，PCR模板的话浓度达到10都完全可以用，如果有100，担心模板中可能有污染物，你可稀释十倍在做模板也行。质粒抽提一般都可以达到上百吧。PCR条件没多少问题，退火温度可以尝试优化一下，变性、退火、延伸30s都足够，循环一般30-35。
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7楼2014-07-29 15:19:22
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hnsea

铜虫 (小有名气)
内容已删除
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当我哭泣我没有好看的鞋子时， 却发现有人连脚都没有。
8楼2014-07-29 22:37:36
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zff922

金虫 (正式写手)
虽然看的晚了，但是还是忍不住说两句，首先楼主的水平太低了，另外回答者都是针对的一些细枝末节的地方挑毛病，也算是无病呻吟吧。首先有说电压的，有说PCR体系的还有说模版的。我都无语了，如果楼主用试剂盒抽质粒或者PCR都有问题，我真是要佩服了。按部就班的东西很少出错的，电压160V和100V跑出来的效果也不会差太多，胶做不好可以重复一下用MARKER做对照。
总之，我认为如果不是楼主失误的话，就是质粒很不就不是阳性质粒，你应该以菌落PCR先鉴定，而且引物要一个是目的基因的一个是vector上的通用引物。阳性的就可以摇菌抽质粒了。抽出来的质粒其实不需要再鉴定了，不过保险一点再鉴定也可以，模版0.2微升就可以。后面要是有问题就是初级水平的问题。至少是大学生水平不应该出的问题更别说研究生了。
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每天都充实，有意义。
9楼2014-12-03 14:27:11
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