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hnsea铜虫 (小有名气)
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细菌质粒提取及ＰＣＲ 已有4人参与
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如题，细菌用小提试剂盒提取质粒，浓度在几十至100ug/ml。 进行多个相关耐药基因（200-500bp）扩增并电泳检测，没有一个条带。marker(1000bp)也不亮，没完全分开。 是操作设计不好吗啊？ 请分析下原因。 pcr条件如下:94度预热5-8min，94变性40S，Tm减5度退火40S,72度再延伸40s，重复30个循环，72度再延伸5min，4度保持。 琼脂糖电泳条件:1%的胶，120ev，120mA. |
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songzuowei
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2楼2014-07-28 09:37:50
hnsea
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5楼2014-07-29 00:10:56
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I give you a experiment plan: first: Agarose electrophoresis conditions: 0.8% glue, 120 V, 100mA. second: PCR conditions : preheated 94 degrees 9 min, 94 modified 30S, annealing of 30S, extends 30s, repeated for 28 cycles, 72 degrees and then extends 5min, 4 degrees. |
6楼2014-07-29 14:24:20
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| 一半电泳时电压120V电流不会有那么高吧，当电流升高太多，这个时候电泳缓冲液肯定是要换了的。如果片段较小，可以采用较大浓度的胶（1.5%-2%），电压80-100v可能能跑的更清楚，PCR模板的话浓度达到10都完全可以用，如果有100，担心模板中可能有污染物，你可稀释十倍在做模板也行。质粒抽提一般都可以达到上百吧。PCR条件没多少问题，退火温度可以尝试优化一下，变性、退火、延伸30s都足够，循环一般30-35。 |
7楼2014-07-29 15:19:22
hnsea
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8楼2014-07-29 22:37:36
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虽然看的晚了，但是还是忍不住说两句，首先楼主的水平太低了，另外回答者都是针对的一些细枝末节的地方挑毛病，也算是无病呻吟吧。首先有说电压的，有说PCR体系的还有说模版的。我都无语了，如果楼主用试剂盒抽质粒或者PCR都有问题，我真是要佩服了。按部就班的东西很少出错的，电压160V和100V跑出来的效果也不会差太多，胶做不好可以重复一下用MARKER做对照。 总之，我认为如果不是楼主失误的话，就是质粒很不就不是阳性质粒，你应该以菌落PCR先鉴定，而且引物要一个是目的基因的一个是vector上的通用引物。阳性的就可以摇菌抽质粒了。抽出来的质粒其实不需要再鉴定了，不过保险一点再鉴定也可以，模版0.2微升就可以。后面要是有问题就是初级水平的问题。至少是大学生水平不应该出的问题更别说研究生了。 |
9楼2014-12-03 14:27:11
