| 查看: 1253 | 回复: 8 | |||
hnsea铜虫 (小有名气)
|
[求助]
细菌质粒提取及ＰＣＲ 已有4人参与
|
|
如题，细菌用小提试剂盒提取质粒，浓度在几十至100ug/ml。 进行多个相关耐药基因（200-500bp）扩增并电泳检测，没有一个条带。marker(1000bp)也不亮，没完全分开。 是操作设计不好吗啊？ 请分析下原因。 pcr条件如下:94度预热5-8min，94变性40S，Tm减5度退火40S,72度再延伸40s，重复30个循环，72度再延伸5min，4度保持。 琼脂糖电泳条件:1%的胶，120ev，120mA. |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有114人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 我做质粒扩增诱变pcr 结果正确，但是转化进入感受态不长菌，为何？
已经有3人回复
- 菌落PCR有目的条带，重组质粒提取PCR却没条带，请问是什么原因？
已经有13人回复
- 质粒的提取及测序问题
已经有9人回复
- 重组质粒，摇菌提取质粒后，如何测序？
已经有5人回复
- 细菌质粒提取浓度太低求助
已经有29人回复
- 如何获取目的质粒？
已经有8人回复
- 如何构建质粒以及提取它
已经有4人回复
- 绝对定量荧光PCR中做标准曲线的DNA的获得。
已经有10人回复
- 质粒鉴定是送菌种，还是送已经提好了的质粒好
已经有12人回复
- 有谁做过细菌的PCR实验吗？
已经有7人回复
- 转化后提不出质粒
已经有11人回复
- 质粒大提，摇菌时间过久对提取的质粒有影响吗？
已经有5人回复
- 菌液pcr出来后，质粒提不出，测序老失败？
已经有6人回复
- 菌液PCR没东西，但是提完质粒能跑出来条带，为什么啊？
已经有16人回复
- 求解释这pcr是啥问题，帮同学问的^_^
已经有29人回复
- 血液中提取细菌DNA
已经有5人回复
- PCR扩增法制备低拷贝质粒（替代常规质粒提取）
已经有11人回复
- 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助
已经有31人回复
- 求帮忙分析下菌液PCR检测结果
已经有19人回复
- 如何提取农杆菌质粒
已经有11人回复
- 【求助/交流】连接产物转化后菌落PCR正确，提取的质粒却比空质粒还小？
已经有4人回复
- 【求助/交流】细菌基因组DNA的提取法（CTAB/NaCl 法）,提取的DNA是否为细菌总DNA? 非�
已经有11人回复
songzuowei
木虫 (著名写手)
- 应助: 88 (初中生)
- 金币: 2666.2
- 散金: 18
- 红花: 7
- 帖子: 2058
- 在线: 98.5小时
- 虫号: 2469387
- 注册: 2013-05-17
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2014-07-28 09:37:50
hnsea
铜虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1837.8
- 散金: 7
- 帖子: 249
- 在线: 488小时
- 虫号: 2853503
- 注册: 2013-12-06
- 性别: MM
- 专业: 环境卫生
3楼2014-07-28 09:51:01
鬼羽帝魂
木虫 (著名写手)
- 应助: 183 (高中生)
- 金币: 3100.2
- 散金: 19
- 红花: 12
- 帖子: 1427
- 在线: 186.8小时
- 虫号: 2538789
- 注册: 2013-07-09
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2014-07-28 10:51:00
hnsea
铜虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1837.8
- 散金: 7
- 帖子: 249
- 在线: 488小时
- 虫号: 2853503
- 注册: 2013-12-06
- 性别: MM
- 专业: 环境卫生
5楼2014-07-29 00:10:56
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hnsea: 金币+2, ★有帮助 2014-07-29 22:50:54
感谢参与，应助指数 +1
hnsea: 金币+2, ★有帮助 2014-07-29 22:50:54
|
I give you a experiment plan: first: Agarose electrophoresis conditions: 0.8% glue, 120 V, 100mA. second: PCR conditions : preheated 94 degrees 9 min, 94 modified 30S, annealing of 30S, extends 30s, repeated for 28 cycles, 72 degrees and then extends 5min, 4 degrees. |
6楼2014-07-29 14:24:20
499649610
金虫 (小有名气)
- 应助: 23 (小学生)
- 金币: 886.9
- 散金: 30
- 帖子: 109
- 在线: 34.5小时
- 虫号: 1424423
- 注册: 2011-10-01
- 专业: 临床生物化学检验
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-29 16:41:08
gyesang: 回帖置顶 2014-07-29 16:41:11
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-29 16:41:08
gyesang: 回帖置顶 2014-07-29 16:41:11
| 一半电泳时电压120V电流不会有那么高吧，当电流升高太多，这个时候电泳缓冲液肯定是要换了的。如果片段较小，可以采用较大浓度的胶（1.5%-2%），电压80-100v可能能跑的更清楚，PCR模板的话浓度达到10都完全可以用，如果有100，担心模板中可能有污染物，你可稀释十倍在做模板也行。质粒抽提一般都可以达到上百吧。PCR条件没多少问题，退火温度可以尝试优化一下，变性、退火、延伸30s都足够，循环一般30-35。 |
7楼2014-07-29 15:19:22
hnsea
铜虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1837.8
- 散金: 7
- 帖子: 249
- 在线: 488小时
- 虫号: 2853503
- 注册: 2013-12-06
- 性别: MM
- 专业: 环境卫生
8楼2014-07-29 22:37:36
zff922
金虫 (正式写手)
- 应助: 5 (幼儿园)
- 金币: 1513.3
- 红花: 1
- 帖子: 559
- 在线: 55.7小时
- 虫号: 3159527
- 注册: 2014-04-24
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
|
虽然看的晚了，但是还是忍不住说两句，首先楼主的水平太低了，另外回答者都是针对的一些细枝末节的地方挑毛病，也算是无病呻吟吧。首先有说电压的，有说PCR体系的还有说模版的。我都无语了，如果楼主用试剂盒抽质粒或者PCR都有问题，我真是要佩服了。按部就班的东西很少出错的，电压160V和100V跑出来的效果也不会差太多，胶做不好可以重复一下用MARKER做对照。 总之，我认为如果不是楼主失误的话，就是质粒很不就不是阳性质粒，你应该以菌落PCR先鉴定，而且引物要一个是目的基因的一个是vector上的通用引物。阳性的就可以摇菌抽质粒了。抽出来的质粒其实不需要再鉴定了，不过保险一点再鉴定也可以，模版0.2微升就可以。后面要是有问题就是初级水平的问题。至少是大学生水平不应该出的问题更别说研究生了。 |
9楼2014-12-03 14:27:11
