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hnsea铜虫 (小有名气)
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[求助]
细菌质粒提取及ＰＣＲ 已有4人参与
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如题，细菌用小提试剂盒提取质粒，浓度在几十至100ug/ml。 进行多个相关耐药基因（200-500bp）扩增并电泳检测，没有一个条带。marker(1000bp)也不亮，没完全分开。 是操作设计不好吗啊？ 请分析下原因。 pcr条件如下:94度预热5-8min，94变性40S，Tm减5度退火40S,72度再延伸40s，重复30个循环，72度再延伸5min，4度保持。 琼脂糖电泳条件:1%的胶，120ev，120mA. |
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499649610
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【答案】应助回帖
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gyesang: 回帖置顶 2014-07-29 16:41:11
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gyesang: 回帖置顶 2014-07-29 16:41:11
| 一半电泳时电压120V电流不会有那么高吧，当电流升高太多，这个时候电泳缓冲液肯定是要换了的。如果片段较小，可以采用较大浓度的胶（1.5%-2%），电压80-100v可能能跑的更清楚，PCR模板的话浓度达到10都完全可以用，如果有100，担心模板中可能有污染物，你可稀释十倍在做模板也行。质粒抽提一般都可以达到上百吧。PCR条件没多少问题，退火温度可以尝试优化一下，变性、退火、延伸30s都足够，循环一般30-35。 |
7楼2014-07-29 15:19:22
songzuowei
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hnsea
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3楼2014-07-28 09:51:01
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