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质粒酶切条带问题 已有2人参与
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质粒构建好之后没有做酶切鉴定，直接送去测序了，测序是正确的。可现在做双酶切时总是有些问题。如图： 1 marker 2 质粒 3BamH1单酶切 4Xhol单酶切 5 双酶切 BamH1酶切时大片段下面出现了两条带 xhol酶切时大片段上面还有一条条带，是没有切开的吗？ 双酶切时也出现了大片段下面的两条带。不知道这个是什么。 还有因为目的片段才200bp，所以前几次做酶切时总是看不到，是因为太小了吗？ 谢谢  2014-07-27酶切.jpg |
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8楼2014-07-28 16:14:48
gyesang
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luwei13566
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2014-07-28 08:42:27
coffee159: 金币+4, ★★★很有帮助, 谢谢，因为当时是用重叠PCR的方法，通过pcr载体把目的基因插入的，所以没办法pcr验证。还有，最近提的质粒，大小8000bp,酶切后总是在15000作用有一条带，我不清楚这个是什么原因。质粒不纯的话测序能测出来吗？ 2014-07-28 09:36:07
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1.BamHI酶切应该是出现star活性了。你的基因才200bp，下面两条带肯定是切到载体上了，还有略微弥散，我记得这个酶稳定性不好。最好不要长时间切。 2.XhoI上面那个带和你的质粒对照应该是开环质粒无误。延长切割时间就消失掉了。 3.双酶切下面那两条带还是BamHI的star活性，至于你下面那个不亮很正常，因为首先你的基因不一定完全释放，可能一部分基因只是一端被切开，另一端还在载体上，就算你完全双酶切后基因和载体的摩尔比是1比1，但是你的载体远大于你的基因，嵌入的EB也远比你基因多。 4.酶切效果不好可以换PCR验证。 |
3楼2014-07-27 23:14:27
4楼2014-07-28 09:37:27
